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PCR儀使用方法

[2011/9/1]

(一)試劑PCR儀 
　　(1)引物：決定擴(kuò)增的特異性。根據(jù)檢測的DNA不同，選用不同引物，每種病原微生 
　　物都有自己特異的引物。 
　　(2)耐熱的DNA聚合酶：此酶是從耐熱細(xì)菌中分離出來的，能耐受高溫90℃-100℃。 
　　(3)10×PCR緩沖液：500mmol/l KCl;100mmol/L Tris-HCl(pH8.4,20℃)150mmol/L MgCl2,1mg/ml明膠。10×PCR緩沖液隨酶一起購買。 
　　(4)5mmol/L dNTP貯備液：將dATP、dCTP、dGTP和dTTP鈉鹽各100mg合并，加入滅菌去離子水溶解，用NaOH調(diào)pH至中性，分裝每份300μl，-20℃保存。dNTP濃度最好用UV吸收法精確測定。現(xiàn)用dNTP溶液均有商品化產(chǎn)品。 
　　(5)DNA模板：用處理液將待測標(biāo)本處理，不同處理方法、操作各異，但目的是暴露標(biāo)本中被檢測的DNA。 
　　(二)操作程序PCR儀 
　　過去標(biāo)準(zhǔn)的PCR操作程序是將PCR儀必需反應(yīng)成份分別加入一微量離心管中，然后置于一定的循環(huán)參數(shù)條件下進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增。具體如下： 
　　(1)向一微量離心管中依次加入 
　　DNA模板　　　　　　 102-105拷貝 
　　引物　　　　　　　　　 各1μmol/L 
　　dNTP　 　　　　　 各200μmol/L 
　　10×PCR緩沖液　　1/10體積 
　　ddH2O　　　　　補(bǔ)到終體積(終體積50μl-100μl) 
　　混勻后，離心15s使反應(yīng)成分集于管底。以上步驟僅在實(shí)驗(yàn)研究用，現(xiàn)在商品化試劑已將dNTP、10×PCR緩沖液，引物，ddH2O混合在一起，反應(yīng)體積為20-25μl，只要試驗(yàn)人員加入處理好的樣品就可以了。 
　　(2)加石蠟油50-100μl于反應(yīng)液表面以防蒸發(fā)。置反應(yīng)管于97℃變性10min。 
　　(3)冷至延伸溫度時(shí)，加入1-5u Taq DNA聚合酶，離心30s使酶和反應(yīng)液充分混合，F(xiàn)在臨床使用試劑酶通常已加入反應(yīng)液中。 
　　(4)PCR儀的循環(huán)程序?yàn)椋?4℃變性30s，55℃退火20s，然后在72℃延伸30s，共循環(huán)30-35次。最后一次循環(huán)結(jié)束后，再將反應(yīng)管置72℃溫育5min，以確保充分延伸。 
　　PCR儀尚可用于組織標(biāo)本DNA的擴(kuò)增。由于固定組織標(biāo)本的DNA常發(fā)生降解，就給常用的分析方法如Southern轉(zhuǎn)印雜交等帶來一定困難。87年Impraim等人首先將PCR技術(shù)引入固定包埋組織內(nèi)DNA分析。他們先從組織標(biāo)本中提取DNA，再用PCR進(jìn)行特異性的DNA擴(kuò)增，應(yīng)用這種方法，他們成功地從保存30至40年之久的組織標(biāo)本DNA中擴(kuò)增了HPV病毒基因片段。但這種方法需要提取DNA，操作比較繁瑣。1988年Shibata等人對(duì)Impraim的方法進(jìn)行了改進(jìn)。他們將固定包埋的組織塊制成5-10um厚，0.4cm大小的切片。將切片放入容積為500μl的Eppendorf管內(nèi)。加入400μl二甲苯脫脂，離心除去二甲苯，用400μl 95%乙醇洗去殘余二甲苯。離心除盡乙醇、加入100μlPCR反應(yīng)基質(zhì)，將Eppendorf管放入沸水浴中煮10min，然后按前述PCR方法進(jìn)行DNA擴(kuò)增。 
　　在應(yīng)用PCR方法檢測RNA病毒時(shí)，首先應(yīng)將RNA轉(zhuǎn)化成cDNA才能進(jìn)行擴(kuò)增，因?yàn)镻CR只能對(duì)DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，我們把這種RNA的PCR反應(yīng)稱為反轉(zhuǎn)錄PCR，簡稱RT-PCR。把由RNA轉(zhuǎn)化成DNA的過程叫做反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄需要在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下完成。