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顯微鏡的分類知識

[2011/9/16]

　　按使用目鏡的數(shù)目可分為雙目和單目顯微鏡;按圖像是否有立體感可分為立體視覺和非立體視覺顯微鏡;按觀察對像可分為生物和金相顯微鏡等;按光學(xué)原理可分為偏光、相襯和微差干涉對比顯微鏡等;按光源類型可分為普通光、熒光、紫外光、紅外光和激光顯微鏡等;按接收器類型可分為目視、數(shù)碼(攝像)顯微鏡等。常用的顯微鏡有雙目體視顯微鏡、金相顯微鏡、偏光顯微鏡、熒光顯微鏡等。

　　1. 雙目體視顯微鏡

　　雙目體視顯微鏡又稱"實(shí)體顯微鏡"或"解剖鏡"，是一種具有正象立體感地目視儀器。在生物、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛用于切片操作和顯微外科手術(shù);在工業(yè)中用于微小零件和集成電路的觀測、裝配、檢查等工作。它具有如下特點(diǎn)：

　　(1) 利用雙通道光路，雙目鏡筒中的左右兩光束不是平行，而是具有一定的夾角--體視角(一般為12度--15度)，為左右兩眼提供一個具有立體感的圖像。它實(shí)質(zhì)上是兩個單鏡筒顯微鏡并列放置，兩個鏡筒的光軸構(gòu)成相當(dāng)于人們用雙目觀察一個物體時所形成的視角，以此形成三維空間的立體視覺圖像。

　　(2) 象是直立的，便于操作和解剖，這是由于在目鏡下方的棱鏡把象倒轉(zhuǎn)過來的緣故。

　　(3)雖然放大率不如常規(guī)顯微鏡，但其工作距離很長。

　　(4)焦深大，便于觀察被檢物體的全層。

　　(5)視場直徑大。

　　目前體視鏡的光學(xué)結(jié)構(gòu)是：由一個共用的初級物鏡，對物體成象后的兩光束被兩組中間物鏡----變焦鏡分開，并成一體視角再經(jīng)各自的目鏡成象，它的倍率變化是由改變中間鏡組之間的距離而獲得的，因此又稱為"連續(xù)變倍體視顯微鏡"(Zoom-stereo microscope)。隨著應(yīng)用的要求，目前體視鏡可選配豐富的選購附件，如熒光，照相，攝象，冷光源等等。

　　2. 金相顯微鏡

　　金相顯微鏡是專門用于觀察金屬和礦物等不透明物體金相組織的顯微鏡。這些不透明物體無法在普通的透射光顯微鏡中觀察，故金相和普通顯微鏡的主要差別在于前者以反射光，而后者以透射光照明。在金相顯微鏡中照明光束從物鏡方向射到被觀察物體表面，被物面反射后再返回物鏡成像。這種反射照明方式也廣泛用于集成電路硅片的檢測工作。

　　3. 偏光顯微鏡(Polarizing microscope)

　　偏光顯微鏡(polarizing microscope)用于檢測具有雙折射性的物質(zhì)，如纖維絲、紡錘體、膠原、染色體等等。和普通顯微鏡不同的是：其光源前有偏振片(起偏器)，使進(jìn)入顯微鏡的光線為偏振光，鏡筒中有檢偏器(一個偏振方向與起偏器垂直的的起偏器)，這種顯微鏡的載物臺是可以旋轉(zhuǎn)的，當(dāng)載物臺上放入單折射的物質(zhì)時，無論如何旋轉(zhuǎn)載物臺，由于兩個偏振片是垂直的，顯微鏡里看不到光線，而放入雙折射性物質(zhì)時，由于光線通過這類物質(zhì)時發(fā)生偏轉(zhuǎn)，因此旋轉(zhuǎn)載物臺便能檢測到這種物體。

　　偏光顯微鏡是用于研究所謂透明與不透明各向異性材料的一種顯微鏡。凡具有雙折射的物質(zhì)，在偏光顯微鏡下就能分辨的清楚，當(dāng)然這些物質(zhì)也可用染色法來進(jìn)行觀察，但有些則不可能，而必須利用偏光顯微鏡。

　　(1) 偏光顯微鏡的特點(diǎn)

　　將普通光改變?yōu)槠窆膺M(jìn)行鏡檢的方法，以鑒別某一物質(zhì)是單折射(各向同行)或雙折射性(各向異性)。雙折射性是晶體的基本特性。因此，偏光顯微鏡被廣泛地應(yīng)用在礦物、化學(xué)等領(lǐng)域，在生物學(xué)和植物學(xué)也有應(yīng)用。

　　(2) 偏光顯微鏡的基本原理

　　偏光顯微鏡的原理比較復(fù)雜，在此不作過多介紹,偏光顯微鏡必須具備以下附件：起偏鏡，檢偏鏡，補(bǔ)償器或相位片，專用無應(yīng)力物鏡，旋轉(zhuǎn)載物臺。

　　(3) 偏光鏡檢術(shù)的方式

　　正相鏡檢(Orthscope):又稱無畸變鏡檢，其特點(diǎn)是使用低倍物鏡，不用伯特蘭透鏡(Bertrand Lens),

　　被研究對象可直接用偏振光研究。同時為使照明孔徑變小，推開聚光鏡的上透鏡。正相鏡檢用于檢查物體的雙折射性。

　　b. 錐光鏡檢(Conoscope)：又稱干涉鏡檢，研究在偏振光干涉時產(chǎn)生的干涉圖樣，這種方法用于觀察物體的單軸或雙軸性。在該方法中，用強(qiáng)會聚偏振光束照明。

　　(4) 偏光顯微鏡在裝置上的要求

　　a. 光源：最好采用單色光，因?yàn)楣獾乃俣，折射率，和干涉現(xiàn)象由于波長的不同而有差異。一般鏡檢可使用普通光。

　　b. 目鏡：要帶有十字線的目鏡。

　　c. 聚光鏡：為了取得平行偏光，應(yīng)使用能推出上透鏡的搖出式聚光鏡。

　　d. 伯特蘭透鏡：聚光鏡光路中的輔助部件，這是把物體所有造成的初級相放大為次級相的輔助透鏡。它可保證用目鏡來觀察在物鏡后焦平面中形成的平涉圖樣。

　　(5) 偏光鏡檢術(shù)的要求

　　a. 載物臺的中心與光軸同軸。

　　b. 起偏鏡和檢偏鏡應(yīng)處于正交位置。

　　c. 制片不宜過薄。

　　4. 熒光顯微鏡

　　熒光顯微鏡是用短波長的光線照射用熒光素染色過的被檢物體，使之受激發(fā)后而產(chǎn)生長波長的熒光，然后觀察。熒光顯微鏡廣泛應(yīng)用于生物，醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。

　　(1) 熒光顯微鏡一般分為透射和落射式兩種類型。

　　a. 透射式：激發(fā)光來自被檢物體的下方，聚光鏡為暗視野聚光鏡，使激發(fā)光不進(jìn)入物鏡，而使熒光進(jìn)入物鏡。它在低倍情況下明亮，而高倍則暗，在油浸和調(diào)中時，較難操作，尤以低倍的照明范圍難于確定，但能得到很暗的視野背景。透射式不使用于非透明的被檢物體。

　　b. 落射式：透射式目前幾乎被淘汰，新型的熒光顯微鏡多為落射式，光源來自被檢物體的上方，在光路中具有分光鏡，所以對透明和不透明的被檢物體都適用。由于物鏡起了聚光鏡的作用，不僅便于操作，而且從低倍到高倍，可以實(shí)現(xiàn)整個視場的均勻照明。

　　(2) 熒光鏡檢術(shù)的注意事項(xiàng)

　　a. 激發(fā)光長時間的照射，會發(fā)生熒光的衰減和淬滅現(xiàn)象，因此盡可能縮短觀察時間，暫時不觀察時，應(yīng)用擋板遮蓋激發(fā)光。

　　b. 作油鏡觀察時，應(yīng)用"無熒光油"。

　　c. 熒光幾乎都較弱，應(yīng)在較暗的室內(nèi)進(jìn)行。

　　d. 電源最好裝穩(wěn)壓器，否則電壓不穩(wěn)不僅會降低汞燈的壽命，也會影響鏡檢的效果。

　　目前許多新興生物研究領(lǐng)域應(yīng)用到熒光顯微鏡，如基因原位雜交(FISH)等等。

　　5. 相襯顯微鏡(Phase contrast microscope)

　　在光學(xué)顯微鏡的發(fā)展過程中，相襯鏡檢術(shù)的發(fā)明成功，是近代顯微鏡技術(shù)中的重要成就。我們知道，人眼只能區(qū)分光波的波長(顏色)和振幅(亮度)，對于無色通明的生物標(biāo)本，當(dāng)光線通過時，波長和振幅變化不大，在明場觀察時很難觀察到標(biāo)本。

　　相襯顯微鏡利用被檢物體的光程之差進(jìn)行鏡檢，也就是有效地利用光的干涉現(xiàn)象，將人眼不可分辨的相位差變?yōu)榭煞直娴恼穹睿词故菬o色透明的物質(zhì)也可成為清晰可見。這大大便利了活體細(xì)胞的觀察，因此相襯鏡檢法廣泛應(yīng)用于倒置顯微鏡中。

　　相襯鏡檢法在裝置上與明場不同，有一些特殊要求：

　　a. 環(huán)狀光闌(Ring slit): 裝在聚光鏡的下方，而與聚光鏡組合為一體---相襯聚光鏡。它是由大a.

　　小不同的環(huán)形光闌裝在一圓盤內(nèi)，外面標(biāo)有10X、20X、40X、100X等字樣，與相對應(yīng)倍數(shù)的物鏡配合使用。

　　b. 相板(Phase plate):

　　裝在物鏡的后焦平面處，它分為兩部分，一是通過直射光的部分，為半透明的環(huán)狀，叫共軛面;另一是通過衍射光的部分，?quot;補(bǔ)償面"。有相板的物鏡稱"相襯物鏡"，外殼上常有"Ph"字樣。

　　相襯鏡檢法是一種比較復(fù)雜的鏡檢方法，想要得到好的觀察效果，顯微鏡的調(diào)試非常重要。除此之外還應(yīng)注意以下幾個方面：

　　a. 光源要強(qiáng)，全部開啟孔徑光闌;

　　b. 使用濾色片，使光波近于單色。

　　6. 微分干涉對比顯微鏡(Differential interference contrast DIC)

　　1952年，Nomarski在相差顯微鏡原理的基礎(chǔ)上發(fā)明了微分干涉差顯微鏡(differential interference contrast microscope)。DIC顯微鏡又稱Nomarski相差顯微鏡(Nomarki contrast microscope)，其優(yōu)點(diǎn)是能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影影像。與相差顯微鏡相比，其標(biāo)本可略厚一點(diǎn)，折射率差別更大，故影像的立體感更強(qiáng)。DIC顯微鏡的物理原理完全不同于相差顯微鏡，技術(shù)設(shè)計(jì)要復(fù)雜得多。DIC利用的是偏振光，有四個特殊的光學(xué)組件：偏振器(polarizer)、DIC棱鏡、DIC滑行器和檢偏器(analyzer)。偏振器直接裝在聚光系統(tǒng)的前面，使光線發(fā)生線性偏振。在聚光器中則安裝了石英Wollaston棱鏡，即DIC棱鏡，此棱鏡可將一束光分解成偏振方向不同的兩束光(x和y)，二者成一小夾角。聚光器將兩束光調(diào)整成與顯微鏡光軸平行的方向。最初兩束光相位一致，在穿過標(biāo)本相鄰的區(qū)域后，由于標(biāo)本的厚度和折射率不同，引起了兩束光發(fā)生了光程差。在物鏡的后焦面處安裝了第二個Wollaston棱鏡，即DIC滑行器，它把兩束光波合并成一束。這時兩束光的偏振面(x和y)仍然存在。最后光束穿過第二個偏振裝置，即檢偏器。在光束形成目鏡DIC影像之前，檢偏器與偏光器的方向成直角。檢偏器將兩束垂直的光波組合成具有相同偏振面的兩束光，從而使二者發(fā)生干涉。x和y波的光程差決定著透光的多少。光程差值為0時，沒有光穿過檢偏器;光程差值等于波長一半時，穿過的光達(dá)到最大值。于是在灰色的背景上，標(biāo)本結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出亮暗差。為了使影像的反差達(dá)到最佳狀態(tài)，可通過調(diào)節(jié)DIC滑行器的縱行微調(diào)來改變光程差，光程差可改變影像的亮度。調(diào)節(jié)DIC滑行器可使標(biāo)本的細(xì)微結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出正或負(fù)的投影形象，通常是一側(cè)亮，而另一側(cè)暗，這便造成了標(biāo)本的人為三維立體感，類似大理石上的浮雕。

　　微分干涉對比鏡檢術(shù)出現(xiàn)于60年代，它不僅能觀察無色透明的物體，而且圖象呈現(xiàn)出浮雕壯的立體感，并具有相襯鏡檢術(shù)所不能達(dá)到的某些優(yōu)點(diǎn)，觀察效果更為逼真。

　　(1) 原理

　　微分干涉對比鏡檢術(shù)是利用特制的渥拉斯頓棱鏡來分解光束。分裂出來的光束的振動方向相互垂直且強(qiáng)度相等，光束分別在距離很近的兩點(diǎn)上通過被檢物體，在相位上略有差別。由于兩光束的裂距極小，而不出現(xiàn)重影現(xiàn)象，使圖象呈現(xiàn)出立體的三維感覺。

　　(2) 微分干涉對比鏡檢術(shù)所需的特殊部件：

　　a. 起偏鏡

　　b. 檢偏鏡

　　c. 渥拉斯頓棱鏡2 塊

　　(3) 微分干涉對比鏡檢時的注意事項(xiàng)

　　a. 因微分干涉靈敏度高，制片表面不能有污物和灰塵。

　　b. 具有雙折射性的物質(zhì)，不能達(dá)到微分干涉對比鏡檢的效果。

　　c. 倒置顯微鏡應(yīng)用微分干涉時，不能用塑料培養(yǎng)皿。

　　7. 倒置顯微鏡(Inverted microscope)

　　倒置顯微鏡是為了適應(yīng)生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中的組織培養(yǎng)、細(xì)胞離體培養(yǎng)、浮游生物、環(huán)境保護(hù)、食品檢驗(yàn)等顯微觀察。

　　由于上述樣品特點(diǎn)的限制，被檢物體均放置在培養(yǎng)皿(或培養(yǎng)瓶)中，這樣就要求倒置顯微鏡的物鏡和聚光鏡的工作距離很長，能直接對培養(yǎng)皿中的被檢物體進(jìn)行顯微觀察和研究。因此，物鏡、聚光鏡和光源的位置都顛倒過來，故稱為"倒置顯微鏡"。

　　由于工作距離的限制，倒置顯微鏡物鏡的最大放大率為60X。一般研究用倒置顯微鏡都配置有4X、10X、20X、及40X

　　相差物鏡，因?yàn)榈怪蔑@微鏡多用于無色透明的活體觀察。如果用戶有特殊需要，也可以選配其它附件，用來完成微分干涉、熒光及簡易偏光等觀察。

　　目見倒置顯微鏡廣泛應(yīng)用于patch-clamp ,transgene ICSI 等領(lǐng)域。

　　8. 數(shù)碼顯微鏡

　　數(shù)碼顯微鏡是以攝像頭(即電視攝像靶或電荷耦合器)作為接收元件的顯微鏡。在顯微鏡的實(shí)像面處裝入攝像頭取代人眼作為接收器，通過這種光電器件把光學(xué)圖像轉(zhuǎn)換成電信號的圖像，然后對之進(jìn)行尺寸檢測、顆粒計(jì)數(shù)等工作。這類顯微鏡可以與計(jì)算機(jī)聯(lián)用，這便于實(shí)現(xiàn)檢測和信息處理的自動化，多應(yīng)用于需要進(jìn)行大量繁瑣檢測工作的場合。