流式細(xì)胞術(shù)及其臨床應(yīng)用
[2011/9/23]
流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry FCM)是對(duì)單個(gè)細(xì)胞或其他生物微粒進(jìn)行快速定量分析和分選的一門技術(shù)。在分析或分選過(guò)程中，包繞在流動(dòng)液體中處理過(guò)的單個(gè)細(xì)胞或微粒通過(guò)聚焦的光源，產(chǎn)生電信號(hào)，這些信號(hào)代表光散射、熒光等參數(shù)，以此測(cè)定出細(xì)胞或微粒的物理和化學(xué)性質(zhì)，并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度的細(xì)胞亞群，以對(duì)其進(jìn)一步的培養(yǎng)或分析。包繞細(xì)胞的液流稱為鞘液。所用儀器稱為流式細(xì)胞儀(flowcytometer FCM)。流式細(xì)胞術(shù)綜合了光學(xué)、電子學(xué)、流體力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、免疫學(xué)、激光技術(shù)和計(jì)算機(jī)科學(xué)等多門學(xué)科和技術(shù)，具有檢測(cè)速度快、精確、測(cè)量指標(biāo)多、采集數(shù)據(jù)量大、分析全面、方法靈活等特點(diǎn)。
一、流式細(xì)胞儀(flowcytometer FCM)
1.流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)
流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)一般可分四部分。
(1)流動(dòng)系統(tǒng)
流動(dòng)系統(tǒng)是流式細(xì)胞儀的心臟，因?yàn)榧?xì)胞懸液在被檢測(cè)之前必須首先形成一個(gè)很細(xì)的穩(wěn)流，細(xì)胞在其內(nèi)部排成單列通過(guò)測(cè)量區(qū)。細(xì)胞懸液和鞘液分別(是分別還是同時(shí))進(jìn)入流動(dòng)室，鞘液的作用是使樣品懸液中的粒子組成單一縱列方式通過(guò)測(cè)量區(qū)，保證每個(gè)細(xì)胞通過(guò)激光照射區(qū)的時(shí)間相等，從而得到準(zhǔn)確的細(xì)胞熒光信息。
(2)激光系統(tǒng)
多采用氬離子激光器。使發(fā)射光在可見(jiàn)光譜范圍內(nèi)488nm激發(fā)。目前市場(chǎng)上大多數(shù)熒光色素適用于此波長(zhǎng)。激光的單色性好，功率高，穩(wěn)定。
(3)光學(xué)和電子系統(tǒng)
激光束射至經(jīng)流體力學(xué)聚焦的個(gè)別細(xì)胞和粒子后，光散射在各個(gè)方向(360?)發(fā)射。有兩個(gè)光散射參數(shù)需收集，前向角散射(FSC)主要用于檢測(cè)細(xì)胞體積的大小。
另一為側(cè)向散射(SSC)用于檢測(cè)細(xì)胞膜，胞質(zhì)，核膜等細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)及胞質(zhì)內(nèi)顆粒。
熒光信號(hào)是由對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色的特異性熒光染料受到激光激發(fā)后發(fā)射的。熒光波長(zhǎng)與激光波長(zhǎng)不同，而且強(qiáng)度較弱，因此要使用光學(xué)濾片濾除非熒光信號(hào)并使用靈敏的檢測(cè)器。熒光測(cè)量時(shí)通常使用線性放大器(即放大器的輸出與輸入是線性關(guān)系)，適用于較小范圍內(nèi)變化的信號(hào)，如前向角散射和DNA測(cè)量。但有時(shí)需要對(duì)數(shù)放大器(即輸出與輸入是對(duì)數(shù)關(guān)系)。如果原來(lái)輸出為1，當(dāng)輸入增加到原來(lái)的10倍時(shí)，輸出是2。在免疫學(xué)檢測(cè)中常使用對(duì)數(shù)放大器，因?yàn)樵诿庖邔W(xué)的樣品中，可能有的細(xì)胞未被染色而僅有自發(fā)熒光，為陰性群體;被染上色的細(xì)胞特異性熒光可能比自發(fā)熒光強(qiáng)數(shù)倍到數(shù)十倍，為陽(yáng)性群體。使用對(duì)數(shù)放大器可以同時(shí)分辨出亮度差異大的多個(gè)細(xì)胞亞群，容易選定不同亞群間的分界點(diǎn)，有利于流式細(xì)胞儀的分析和分選。
熒光信號(hào)的補(bǔ)償：當(dāng)用一種激光束同時(shí)激發(fā)兩種染料發(fā)射出兩種不同波長(zhǎng)的熒光時(shí)，兩種熒光發(fā)射光譜有一定的重迭，可用電補(bǔ)償減去不適合熒光通道測(cè)定的重迭信號(hào)。
(4)數(shù)據(jù)貯存和計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)
數(shù)據(jù)貯存采用列表排隊(duì)(List Mode)方式。利用計(jì)算機(jī)用多種圖形來(lái)表明各參數(shù)間的相互關(guān)系，以單參數(shù)直方圖，雙參數(shù)二維點(diǎn)圖，等高圖等方式顯示。數(shù)據(jù)分析一般設(shè)定正確的分析范圍，劃分計(jì)算區(qū)域和計(jì)算結(jié)果。
(5)細(xì)胞分選系統(tǒng)
細(xì)胞分選可使被指定的細(xì)胞從細(xì)胞群體中分離出來(lái)。流式細(xì)胞儀所測(cè)定的任何參數(shù)都可以作為細(xì)胞分選依據(jù)，被選出來(lái)的細(xì)胞的均一性與所測(cè)參數(shù)有關(guān)。其工作原理是把液滴形成信號(hào)在壓電晶體上使之產(chǎn)生機(jī)械振動(dòng)(不太通順)，液柱斷裂成一連串均勻的液滴，一部分液滴中包有細(xì)胞，如果其特性與被選定要進(jìn)行分選的細(xì)胞特性相符，則帶有特定的電荷。帶有電荷的液滴向下落入偏轉(zhuǎn)板的高壓靜電場(chǎng)時(shí)，偏轉(zhuǎn)落入指定的收集器內(nèi)，完成細(xì)胞分類收集的目的。
2.流式細(xì)胞儀的類型
流式細(xì)胞儀分為兩大類，一類為臨床分析型(又名臺(tái)式機(jī))，特點(diǎn)為儀器光路調(diào)節(jié)系統(tǒng)固定，自動(dòng)化程度高，易學(xué)易掌握。如Becton Dickinson(簡(jiǎn)稱BD)公司的FACSCalibur、Beckman-Coulter公司的EPICSXL、Cytomation公司的MOFLO、Partec公司的Pas、Aber公司的Microcyte、Ortho公司Cytoron等;另一類為科研(分選)型，特點(diǎn)為可快速將所感興趣的細(xì)胞分選出來(lái)，并且將單個(gè)或指定個(gè)數(shù)的細(xì)胞分選到特定的培養(yǎng)孔或板上，同時(shí)可選配多種波長(zhǎng)類型的激光器，適用于更廣泛的科學(xué)研究之用。如BD公司的FACS Vantage，Beckman Coulter公司的EPICSALTRA，Cytomation公司的MOFLOMLS及Partec公司的Pas-III等。最近BD公司推出了FACSAria,其優(yōu)點(diǎn)為具備科研分選型標(biāo)準(zhǔn)而操作與臨床分析型同樣簡(jiǎn)便，自動(dòng)化程度高。
3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)的質(zhì)量控制
(1)樣品與試劑
血液、骨髓、體液等必須當(dāng)天采集，6 h之內(nèi)進(jìn)行免疫熒光染色;活化血小板檢測(cè)應(yīng)在采血后立即染色與固定。組織樣品可采用機(jī)械法去聚集并過(guò)濾，最好用單細(xì)胞制備儀(medimachine)處理。試劑、緩沖液、溶血?jiǎng)⒐潭▌┑缺仨毞蠘?biāo)準(zhǔn)。
(2)對(duì)照設(shè)置
目的是避免各種因素可能造成的假陽(yáng)性或假陰性反應(yīng)。
①同型對(duì)照：與單克隆抗體(MoAb)相同的、未免疫小鼠標(biāo)記熒光素的免疫球蛋白亞類作對(duì)照。主要考慮細(xì)胞的自發(fā)熒光、非特異性抗體結(jié)合等影響因素。
②陽(yáng)性對(duì)照：已知陽(yáng)性標(biāo)本能否確定為陽(yáng)性。達(dá)不到要求時(shí)不能進(jìn)行臨床試驗(yàn)。
、坳幮詫(duì)照：用已知不表達(dá)某種抗原的細(xì)胞作樣品檢測(cè)，應(yīng)出現(xiàn)陰性。目的是避免實(shí)驗(yàn)的非特異性反應(yīng)。
、苷(duì)照：對(duì)一種新的MoAb，在使用前進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)，可保證儀器在最佳條件下獲取樣品。
、葙|(zhì)控品：
試劑廠方提供與待測(cè)樣品成分相近的穩(wěn)定的質(zhì)控物，并提供檢測(cè)項(xiàng)目的靶值和質(zhì)控范圍，作為某一試驗(yàn)項(xiàng)目的全程質(zhì)量檢測(cè)物，評(píng)估試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。如BDMulti-Check Control 是淋巴細(xì)胞及其亞群分析的全血質(zhì)控品。
(3)儀器的校準(zhǔn)與性能檢測(cè)
使用標(biāo)準(zhǔn)熒光微球，運(yùn)行FACSComp軟件，校準(zhǔn)通過(guò)，表明儀器狀況良好。
二、流式細(xì)胞儀的功能和臨床應(yīng)用
流式細(xì)胞儀最大的貢獻(xiàn)在于促進(jìn)了免疫學(xué)基礎(chǔ)研究和臨床診斷。目前流式細(xì)胞術(shù)已被廣泛用于細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、血液學(xué)、病理學(xué)、遺傳學(xué)和臨床檢驗(yàn)等多學(xué)科領(lǐng)域的基礎(chǔ)和臨床研究。
1.流式細(xì)胞儀的功能
(1)細(xì)胞參量分析
包括細(xì)胞大小、形狀、蛋白熒光、氧化還原狀態(tài)，膜的結(jié)構(gòu)、流動(dòng)性、微粘度、膜電位，酶活性，鈣離子含量，pH值，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，DNA合成，堿基比例等。
(2)細(xì)胞表型分析
從1982年正式以CD(clustor of differentiation) 來(lái)表達(dá)(示)白細(xì)胞分化抗原。己確定的CD序號(hào)從CDl一CD247，這些細(xì)胞表面分化抗原，可以將人體組織細(xì)胞分為T細(xì)胞、B細(xì)胞、髓樣細(xì)胞、血小板、NK細(xì)胞、粘附分子、內(nèi)皮細(xì)胞，細(xì)胞因子受體/趨化性細(xì)胞因子受體、干細(xì)胞/祖細(xì)胞、碳水化合物/凝集素、 非譜系組共13系。CD抗原在細(xì)胞表面的獲得和丟失在一定程度上反映細(xì)胞分化程度和功能狀態(tài)。研究CD的意義在于①理解CD抗原分子本身的一些特性及其與免疫功能的關(guān)系;②認(rèn)識(shí)和探討CD抗原所表達(dá)細(xì)胞的功能及其在疾病發(fā)生中的作用。
(3)細(xì)胞分選
這是FCM的一項(xiàng)重要功能，目前FCM對(duì)細(xì)胞亞群的分選純度可以達(dá)到99%，除了對(duì)特定的亞群加以分選外，還可以分出所需要的染色體加以分析甚至能結(jié)合PCR方法加以擴(kuò)增，這多用于研究中。
2.流式細(xì)胞儀檢測(cè)在臨床的應(yīng)用
流式細(xì)胞儀的功能決定了其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要地位，目前在臨床上主要用于細(xì)胞表型分析、造血系腫瘤診斷和分型、移植前配型及與免疫有關(guān)疾病分析等。
(1)CD抗原與白細(xì)胞分析
、賂細(xì)胞
CD3+(注意下面CD分子的格式應(yīng)一致)：成熟T淋巴細(xì)胞，是鑒定T細(xì)胞的重要標(biāo)志，判斷細(xì)胞免疫狀況。
CD4+： T輔助/誘導(dǎo)細(xì)胞亞群
CD8+： T抑制/細(xì)胞毒亞群
CD4+ /CD8+比值：是免疫狀態(tài)標(biāo)志的檢測(cè)指標(biāo)，正常CD4+ /CD8+比值為1.2∽2.9,在腫瘤、免疫缺陷病、病毒感染、自身免疫病、器官移植后都有診斷、預(yù)后和治療的指導(dǎo)價(jià)值，其比例降低與病變程度有關(guān)。
CD8+ /CD28+ 與CD8+ /CD28—：前者為細(xì)胞毒T細(xì)胞(Tc)，后者為抑制性T細(xì)胞(Ts)。
CD4+/CD25+ 與CD4+ /CD25—：前者為免疫調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，后者為效應(yīng)T細(xì)胞。
CD4+ /CD29+：輔助性誘導(dǎo)細(xì)胞，輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體和誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞溶解作用，自身免疫性疾病可見(jiàn)增多。
CD4+ /CD 45RA+ 與CD4+ /CD 45Ro+：前者為原初細(xì)胞(naive cell)主要功能是誘導(dǎo)Ts細(xì)胞活化和輔助其功能活性。SLE、MS患者外周血CD4+ /CD 45RA+細(xì)胞減少，后者為記憶細(xì)胞(memory cell)。
、贐淋巴細(xì)胞：CD19+是總的B淋巴細(xì)胞特異抗原，判斷體液免疫狀況。CD23+為IgE低親和力受體，分布于B淋巴細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞上，增多與變態(tài)反應(yīng)性疾病、腎病綜合癥、白血病等有關(guān)。
、跱K淋巴細(xì)胞： CD3—/CD(16+56)+ 細(xì)胞表型。
、軉魏/巨噬細(xì)胞標(biāo)志：CD14+細(xì)胞
(2)CD 抗原與血小板分析
分析單個(gè)血小板或血小板亞群膜糖蛋白，是血小板膜糖蛋白檢測(cè)分析方法學(xué)上的重大發(fā)展，對(duì)先天性與獲得性血小板膜糖蛋白異常所致疾病的診斷，尤其是評(píng)價(jià)血栓性疾病與血栓前狀態(tài)發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中血小板的活化程度及其診斷、治療、預(yù)防等具有特別重要的意義。FCM分析血小板膜糖蛋白方法簡(jiǎn)便、快速、標(biāo)本用量少、靈敏度高、特異性強(qiáng)、結(jié)果準(zhǔn)確，為血小板的基礎(chǔ)和臨床研究提供了嶄新的手段。
CD62p(P選擇素)是一種糖蛋白，存在于血小板α顆粒以及內(nèi)皮細(xì)胞中。CD62p在體內(nèi)或體外刺激后，即轉(zhuǎn)移至膜表面，巨核細(xì)胞也有表達(dá)。CD62p又稱GMP—140或PADGEM蛋白(血小板活化依賴α顆粒膜蛋白)，它在血小板與單核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞相互作用中起關(guān)鍵作用。
CD63為溶酶體膜糖蛋白，在多種細(xì)胞的表面和胞漿內(nèi)，尤其是在血小板內(nèi)部都能檢測(cè)到，血小板活化后即轉(zhuǎn)移至膜表面。
測(cè)血小板相關(guān)免疫球蛋白(PAIg)包括抗IgG、IgM、IgA有助于診斷免疫性血小板減少癥。
一些血小板的胞漿中含有核酸物質(zhì)RNA，可被噻唑橙(Thiazole orange,TO)染色稱網(wǎng)織血小板。網(wǎng)織血小板是剛從骨髓中釋放出來(lái)的血小板，可用于血小板減少性疾病的鑒別診斷和療效監(jiān)測(cè)。
3.輔助白血病和淋巴瘤分型和診斷
FCM是血液病MICC分型法中免疫表型分析的重要手段。免疫分型可為臨床指導(dǎo)治療，判斷預(yù)后，預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)提供幫助。
(1)白血病系列分化抗原：
T淋巴細(xì)胞白血。篊D3、CD5、CD7、CD10
B淋巴細(xì)胞白血。篊Dl9、CD20、CD21、CD22，CDl0
NK細(xì)胞白血。篊Dl6、CD56、CD57
粒細(xì)胞白血。篊Dl3、CD33、MPO(髓過(guò)氧化酶)
單核細(xì)胞白血。篊Dl4、CDl5、 CDl1b
紅血。貉吞堑鞍譇(glycophorinA)，CDl3
巨核細(xì)胞白血。篊D41，CD42、CD61
(2)白血病系列非特異性抗原：
CD34+、HLA-DR+、CD38-為干細(xì)胞、CD34+、HLA-DR+、CD38+為原始細(xì)胞，CD34-、HLA-DR-、CD38+為幼稚細(xì)胞。
白血病細(xì)胞系列確定后，可根據(jù)系列抗原表達(dá)特點(diǎn)選擇單抗進(jìn)一步分亞型。
4.HIV和獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)
HIV主要感染CD4+T細(xì)胞，CD4+受體是病毒進(jìn)入的主要途徑。正常血中CD4+T細(xì)胞約1000細(xì)胞/ul(400---1500細(xì)胞/ul)。<400—500細(xì)胞/ul表示病毒強(qiáng)烈影響免疫系統(tǒng)。<200細(xì)胞/ul即使沒(méi)有癥狀可確定AIDS，有預(yù)后價(jià)值。HIV感染早期CD8+T細(xì)胞增多，發(fā)展為AIDS則下降。
5.DNA含量分析以及細(xì)胞分化周期分析
DNA含量檢測(cè)根據(jù)細(xì)胞周期動(dòng)力學(xué)概念，在一個(gè)周期內(nèi)可分為4個(gè)時(shí)相，依次為G1期、S期、G2期和M期，見(jiàn)圖2。利用DNA分析軟件可以確定各時(shí)相細(xì)胞的比例。能夠進(jìn)行DNA含量分析的標(biāo)本可以是PBL，正常、病變或腫瘤組織，針吸或活檢組織，石蠟包埋組織，胸水、腹水，膀胱沖洗液和體外培養(yǎng)細(xì)胞。
DNA含量分析的目的在于確定某一組織或細(xì)胞群體的增殖狀態(tài)，引入DNA指數(shù)(D1)即DNA倍體的概念可以用于區(qū)別腫瘤的良惡性，惡性腫瘤的增殖狀態(tài)。
二倍體細(xì)胞的DI=1，在臨床上二倍體細(xì)胞DI在0.9—1.0之間，根據(jù)DI可以確定細(xì)胞DNA倍體。
6.化療藥物用藥指導(dǎo)，敏感藥物篩選
藥物作用處理后的細(xì)胞采用Calcein-AM(Florescein-methylene aminodiacetic acid 熒光素亞甲亞氨二醋酸)與PI染色。Calcein-AM 為非熒光乙酰甲氨基酯經(jīng)活細(xì)胞非特異性酯酶水解可變?yōu)闊晒饨Y(jié)合物，而死細(xì)胞不能水解因而無(wú)熒光。死細(xì)胞可被PI染成紅色，活細(xì)胞不被PI染色，兩者區(qū)分明顯，可用以篩選藥物。
7.實(shí)體器官移植配型和排異監(jiān)測(cè)
可判斷受者的免疫狀態(tài)、免疫抑制劑療效和全身免疫抑制程度。移植前交叉配型檢測(cè)類抗原的抗體(PRA)、血管內(nèi)皮細(xì)胞抗原(VEA)抗體，可以提高移植成功率。
8.細(xì)胞凋亡(cell apoptosis)檢測(cè)
細(xì)胞凋亡可清除體內(nèi)有害的細(xì)胞群，維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。細(xì)胞凋亡闡明一些疾病的發(fā)病機(jī)制，導(dǎo)致疾病新療法的出現(xiàn)。FCM利用光散射和熒光染色能夠通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞光散射改變、膜結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)運(yùn)功能改變、DNA含量變化和DNA斷裂點(diǎn)標(biāo)記，從多方面分析和鑒定凋亡。是目前能夠同時(shí)區(qū)分凋亡與壞死的唯一手段。
碘化丙啶(P1)標(biāo)記FCM分析時(shí)，在細(xì)胞周期分析圖中表現(xiàn)為G0/G1期峰前的亞G1期(sub-G1)峰。
位于細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸(Ps)，反轉(zhuǎn)至外側(cè)是凋亡早期膜結(jié)構(gòu)的特異性改變。annexin-V是一種Ca2+依賴的磷脂結(jié)合蛋白，與PS具有高親和力，以酶或熒光素標(biāo)記的annexin-V為探針可鑒定凋亡，與PI結(jié)合經(jīng)流式細(xì)胞儀(FCM)分析，是唯一可區(qū)分凋亡早、晚期(如何區(qū)分)與壞死的方法。見(jiàn)圖3。
9.Th1與Th2細(xì)胞及細(xì)胞因子
輔助性T細(xì)胞根據(jù)其產(chǎn)生的細(xì)胞因子及功能的不同可分為Th1與Th2兩大類。Th1細(xì)胞分泌IL-2、IFNγ、主要參與細(xì)胞免疫;Th2細(xì)胞分泌IL-4、IL-5、IL-6及IL-10，主要參與體液免疫。兩者相互調(diào)節(jié)、相互平衡，其平衡失調(diào)與多種疾病有關(guān)。應(yīng)用流式細(xì)胞儀可檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子。
近年來(lái)美國(guó)BD公司提供CBA(Cytometric bead array),采用一系列微珠組合來(lái)捕獲并結(jié)合流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)溶液中被檢測(cè)物質(zhì)的量。此法優(yōu)點(diǎn)為同時(shí)可檢測(cè)多項(xiàng)指標(biāo)如人Th1/Th2 CBA可檢測(cè)IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNFα、IFNγ;人炎癥性細(xì)胞因子CBA可同時(shí)檢測(cè)IL-8、IL-1β、IL-6、IL-10、TNFα、和IL-12。
10.網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)
傳統(tǒng)技術(shù)用煌焦油藍(lán)染料,染色涂片后,光鏡下計(jì)數(shù),方法費(fèi)時(shí)且只計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞,誤差較大。使用噻唑橙(Thiazole Orange, TO)染料,可與核酸形成熒光-核酸復(fù)合物,流式細(xì)胞儀上檢測(cè)50000個(gè)紅細(xì)胞求得百分率與絕對(duì)數(shù),有助于貧血的鑒別
11.造血干祖細(xì)胞檢測(cè)
骨髓移植的適應(yīng)癥主要有白血病、先天性免疫缺陷病、再障等。骨髓移植實(shí)質(zhì)是造血干細(xì)胞的移植。CD34+細(xì)胞常作為多能干細(xì)胞的標(biāo)志。
骨髓移植前檢測(cè)CD34+細(xì)胞是很重要的一個(gè)步驟。樣品經(jīng)抗CD34+熒光抗體染色，可識(shí)別和定量CD34+細(xì)胞。
12.糖皮質(zhì)激素受體(glycocorticoid receptor,GCR)檢測(cè)
測(cè)GCR常用細(xì)胞溶質(zhì)放射配基受體(請(qǐng)確認(rèn))結(jié)合測(cè)定，它可定量，但需細(xì)胞量多、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)。流式細(xì)胞儀可測(cè)淋巴細(xì)胞總GCR，此法雖半定量，但檢測(cè)所需樣品量少。對(duì)長(zhǎng)期激素治療或確定下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)(HPA)軸功能紊亂，評(píng)估細(xì)胞內(nèi)GCR水平有一定價(jià)值。
13.環(huán)氧合酶(Cyclooxygenase,COX)檢測(cè)
環(huán)氧合酶(COX)是花生四烯酸合成前列腺素(PG)的限速酶。它催化產(chǎn)生的PG參與機(jī)體多種生理和病理生理過(guò)程。COX有兩種類型:COX-1和COX-2。COX-1為結(jié)構(gòu)性的“看家基因”產(chǎn)物,在多數(shù)組織細(xì)胞中持續(xù)低濃度表達(dá)，參與維持機(jī)體正常的生理功能。COX-2為可誘導(dǎo)性的，炎癥、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等刺激可使其大量表達(dá)，參與和加重炎癥反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、新生血管形成，促進(jìn)黏附、抑制免疫與抑制細(xì)胞凋亡。應(yīng)用流式細(xì)胞儀可監(jiān)測(cè)人血單核細(xì)胞經(jīng)LPS刺激后COX-2與COX-1的水平。對(duì)炎癥、血栓、腫瘤等病的發(fā)病機(jī)制、療效和預(yù)后判斷均有一定價(jià)值。
近年來(lái)應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)特異性CTL細(xì)胞、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等亦在迅速開(kāi)展。
一、流式細(xì)胞儀(flowcytometer FCM)
1.流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)
流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)一般可分四部分。
(1)流動(dòng)系統(tǒng)
流動(dòng)系統(tǒng)是流式細(xì)胞儀的心臟，因?yàn)榧?xì)胞懸液在被檢測(cè)之前必須首先形成一個(gè)很細(xì)的穩(wěn)流，細(xì)胞在其內(nèi)部排成單列通過(guò)測(cè)量區(qū)。細(xì)胞懸液和鞘液分別(是分別還是同時(shí))進(jìn)入流動(dòng)室，鞘液的作用是使樣品懸液中的粒子組成單一縱列方式通過(guò)測(cè)量區(qū)，保證每個(gè)細(xì)胞通過(guò)激光照射區(qū)的時(shí)間相等，從而得到準(zhǔn)確的細(xì)胞熒光信息。
(2)激光系統(tǒng)
多采用氬離子激光器。使發(fā)射光在可見(jiàn)光譜范圍內(nèi)488nm激發(fā)。目前市場(chǎng)上大多數(shù)熒光色素適用于此波長(zhǎng)。激光的單色性好，功率高，穩(wěn)定。
(3)光學(xué)和電子系統(tǒng)
激光束射至經(jīng)流體力學(xué)聚焦的個(gè)別細(xì)胞和粒子后，光散射在各個(gè)方向(360?)發(fā)射。有兩個(gè)光散射參數(shù)需收集，前向角散射(FSC)主要用于檢測(cè)細(xì)胞體積的大小。
另一為側(cè)向散射(SSC)用于檢測(cè)細(xì)胞膜，胞質(zhì)，核膜等細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)及胞質(zhì)內(nèi)顆粒。
熒光信號(hào)是由對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色的特異性熒光染料受到激光激發(fā)后發(fā)射的。熒光波長(zhǎng)與激光波長(zhǎng)不同，而且強(qiáng)度較弱，因此要使用光學(xué)濾片濾除非熒光信號(hào)并使用靈敏的檢測(cè)器。熒光測(cè)量時(shí)通常使用線性放大器(即放大器的輸出與輸入是線性關(guān)系)，適用于較小范圍內(nèi)變化的信號(hào)，如前向角散射和DNA測(cè)量。但有時(shí)需要對(duì)數(shù)放大器(即輸出與輸入是對(duì)數(shù)關(guān)系)。如果原來(lái)輸出為1，當(dāng)輸入增加到原來(lái)的10倍時(shí)，輸出是2。在免疫學(xué)檢測(cè)中常使用對(duì)數(shù)放大器，因?yàn)樵诿庖邔W(xué)的樣品中，可能有的細(xì)胞未被染色而僅有自發(fā)熒光，為陰性群體;被染上色的細(xì)胞特異性熒光可能比自發(fā)熒光強(qiáng)數(shù)倍到數(shù)十倍，為陽(yáng)性群體。使用對(duì)數(shù)放大器可以同時(shí)分辨出亮度差異大的多個(gè)細(xì)胞亞群，容易選定不同亞群間的分界點(diǎn)，有利于流式細(xì)胞儀的分析和分選。
熒光信號(hào)的補(bǔ)償：當(dāng)用一種激光束同時(shí)激發(fā)兩種染料發(fā)射出兩種不同波長(zhǎng)的熒光時(shí)，兩種熒光發(fā)射光譜有一定的重迭，可用電補(bǔ)償減去不適合熒光通道測(cè)定的重迭信號(hào)。
(4)數(shù)據(jù)貯存和計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)
數(shù)據(jù)貯存采用列表排隊(duì)(List Mode)方式。利用計(jì)算機(jī)用多種圖形來(lái)表明各參數(shù)間的相互關(guān)系，以單參數(shù)直方圖，雙參數(shù)二維點(diǎn)圖，等高圖等方式顯示。數(shù)據(jù)分析一般設(shè)定正確的分析范圍，劃分計(jì)算區(qū)域和計(jì)算結(jié)果。
(5)細(xì)胞分選系統(tǒng)
細(xì)胞分選可使被指定的細(xì)胞從細(xì)胞群體中分離出來(lái)。流式細(xì)胞儀所測(cè)定的任何參數(shù)都可以作為細(xì)胞分選依據(jù)，被選出來(lái)的細(xì)胞的均一性與所測(cè)參數(shù)有關(guān)。其工作原理是把液滴形成信號(hào)在壓電晶體上使之產(chǎn)生機(jī)械振動(dòng)(不太通順)，液柱斷裂成一連串均勻的液滴，一部分液滴中包有細(xì)胞，如果其特性與被選定要進(jìn)行分選的細(xì)胞特性相符，則帶有特定的電荷。帶有電荷的液滴向下落入偏轉(zhuǎn)板的高壓靜電場(chǎng)時(shí)，偏轉(zhuǎn)落入指定的收集器內(nèi)，完成細(xì)胞分類收集的目的。
2.流式細(xì)胞儀的類型
流式細(xì)胞儀分為兩大類，一類為臨床分析型(又名臺(tái)式機(jī))，特點(diǎn)為儀器光路調(diào)節(jié)系統(tǒng)固定，自動(dòng)化程度高，易學(xué)易掌握。如Becton Dickinson(簡(jiǎn)稱BD)公司的FACSCalibur、Beckman-Coulter公司的EPICSXL、Cytomation公司的MOFLO、Partec公司的Pas、Aber公司的Microcyte、Ortho公司Cytoron等;另一類為科研(分選)型，特點(diǎn)為可快速將所感興趣的細(xì)胞分選出來(lái)，并且將單個(gè)或指定個(gè)數(shù)的細(xì)胞分選到特定的培養(yǎng)孔或板上，同時(shí)可選配多種波長(zhǎng)類型的激光器，適用于更廣泛的科學(xué)研究之用。如BD公司的FACS Vantage，Beckman Coulter公司的EPICSALTRA，Cytomation公司的MOFLOMLS及Partec公司的Pas-III等。最近BD公司推出了FACSAria,其優(yōu)點(diǎn)為具備科研分選型標(biāo)準(zhǔn)而操作與臨床分析型同樣簡(jiǎn)便，自動(dòng)化程度高。
3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)的質(zhì)量控制
(1)樣品與試劑
血液、骨髓、體液等必須當(dāng)天采集，6 h之內(nèi)進(jìn)行免疫熒光染色;活化血小板檢測(cè)應(yīng)在采血后立即染色與固定。組織樣品可采用機(jī)械法去聚集并過(guò)濾，最好用單細(xì)胞制備儀(medimachine)處理。試劑、緩沖液、溶血?jiǎng)⒐潭▌┑缺仨毞蠘?biāo)準(zhǔn)。
(2)對(duì)照設(shè)置
目的是避免各種因素可能造成的假陽(yáng)性或假陰性反應(yīng)。
①同型對(duì)照：與單克隆抗體(MoAb)相同的、未免疫小鼠標(biāo)記熒光素的免疫球蛋白亞類作對(duì)照。主要考慮細(xì)胞的自發(fā)熒光、非特異性抗體結(jié)合等影響因素。
②陽(yáng)性對(duì)照：已知陽(yáng)性標(biāo)本能否確定為陽(yáng)性。達(dá)不到要求時(shí)不能進(jìn)行臨床試驗(yàn)。
、坳幮詫(duì)照：用已知不表達(dá)某種抗原的細(xì)胞作樣品檢測(cè)，應(yīng)出現(xiàn)陰性。目的是避免實(shí)驗(yàn)的非特異性反應(yīng)。
、苷(duì)照：對(duì)一種新的MoAb，在使用前進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)，可保證儀器在最佳條件下獲取樣品。
、葙|(zhì)控品：
試劑廠方提供與待測(cè)樣品成分相近的穩(wěn)定的質(zhì)控物，并提供檢測(cè)項(xiàng)目的靶值和質(zhì)控范圍，作為某一試驗(yàn)項(xiàng)目的全程質(zhì)量檢測(cè)物，評(píng)估試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。如BDMulti-Check Control 是淋巴細(xì)胞及其亞群分析的全血質(zhì)控品。
(3)儀器的校準(zhǔn)與性能檢測(cè)
使用標(biāo)準(zhǔn)熒光微球，運(yùn)行FACSComp軟件，校準(zhǔn)通過(guò)，表明儀器狀況良好。
二、流式細(xì)胞儀的功能和臨床應(yīng)用
流式細(xì)胞儀最大的貢獻(xiàn)在于促進(jìn)了免疫學(xué)基礎(chǔ)研究和臨床診斷。目前流式細(xì)胞術(shù)已被廣泛用于細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、血液學(xué)、病理學(xué)、遺傳學(xué)和臨床檢驗(yàn)等多學(xué)科領(lǐng)域的基礎(chǔ)和臨床研究。
1.流式細(xì)胞儀的功能
(1)細(xì)胞參量分析
包括細(xì)胞大小、形狀、蛋白熒光、氧化還原狀態(tài)，膜的結(jié)構(gòu)、流動(dòng)性、微粘度、膜電位，酶活性，鈣離子含量，pH值，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，DNA合成，堿基比例等。
(2)細(xì)胞表型分析
從1982年正式以CD(clustor of differentiation) 來(lái)表達(dá)(示)白細(xì)胞分化抗原。己確定的CD序號(hào)從CDl一CD247，這些細(xì)胞表面分化抗原，可以將人體組織細(xì)胞分為T細(xì)胞、B細(xì)胞、髓樣細(xì)胞、血小板、NK細(xì)胞、粘附分子、內(nèi)皮細(xì)胞，細(xì)胞因子受體/趨化性細(xì)胞因子受體、干細(xì)胞/祖細(xì)胞、碳水化合物/凝集素、 非譜系組共13系。CD抗原在細(xì)胞表面的獲得和丟失在一定程度上反映細(xì)胞分化程度和功能狀態(tài)。研究CD的意義在于①理解CD抗原分子本身的一些特性及其與免疫功能的關(guān)系;②認(rèn)識(shí)和探討CD抗原所表達(dá)細(xì)胞的功能及其在疾病發(fā)生中的作用。
(3)細(xì)胞分選
這是FCM的一項(xiàng)重要功能，目前FCM對(duì)細(xì)胞亞群的分選純度可以達(dá)到99%，除了對(duì)特定的亞群加以分選外，還可以分出所需要的染色體加以分析甚至能結(jié)合PCR方法加以擴(kuò)增，這多用于研究中。
2.流式細(xì)胞儀檢測(cè)在臨床的應(yīng)用
流式細(xì)胞儀的功能決定了其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要地位，目前在臨床上主要用于細(xì)胞表型分析、造血系腫瘤診斷和分型、移植前配型及與免疫有關(guān)疾病分析等。
(1)CD抗原與白細(xì)胞分析
、賂細(xì)胞
CD3+(注意下面CD分子的格式應(yīng)一致)：成熟T淋巴細(xì)胞，是鑒定T細(xì)胞的重要標(biāo)志，判斷細(xì)胞免疫狀況。
CD4+： T輔助/誘導(dǎo)細(xì)胞亞群
CD8+： T抑制/細(xì)胞毒亞群
CD4+ /CD8+比值：是免疫狀態(tài)標(biāo)志的檢測(cè)指標(biāo)，正常CD4+ /CD8+比值為1.2∽2.9,在腫瘤、免疫缺陷病、病毒感染、自身免疫病、器官移植后都有診斷、預(yù)后和治療的指導(dǎo)價(jià)值，其比例降低與病變程度有關(guān)。
CD8+ /CD28+ 與CD8+ /CD28—：前者為細(xì)胞毒T細(xì)胞(Tc)，后者為抑制性T細(xì)胞(Ts)。
CD4+/CD25+ 與CD4+ /CD25—：前者為免疫調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，后者為效應(yīng)T細(xì)胞。
CD4+ /CD29+：輔助性誘導(dǎo)細(xì)胞，輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體和誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞溶解作用，自身免疫性疾病可見(jiàn)增多。
CD4+ /CD 45RA+ 與CD4+ /CD 45Ro+：前者為原初細(xì)胞(naive cell)主要功能是誘導(dǎo)Ts細(xì)胞活化和輔助其功能活性。SLE、MS患者外周血CD4+ /CD 45RA+細(xì)胞減少，后者為記憶細(xì)胞(memory cell)。
、贐淋巴細(xì)胞：CD19+是總的B淋巴細(xì)胞特異抗原，判斷體液免疫狀況。CD23+為IgE低親和力受體，分布于B淋巴細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞上，增多與變態(tài)反應(yīng)性疾病、腎病綜合癥、白血病等有關(guān)。
、跱K淋巴細(xì)胞： CD3—/CD(16+56)+ 細(xì)胞表型。
、軉魏/巨噬細(xì)胞標(biāo)志：CD14+細(xì)胞
(2)CD 抗原與血小板分析
分析單個(gè)血小板或血小板亞群膜糖蛋白，是血小板膜糖蛋白檢測(cè)分析方法學(xué)上的重大發(fā)展，對(duì)先天性與獲得性血小板膜糖蛋白異常所致疾病的診斷，尤其是評(píng)價(jià)血栓性疾病與血栓前狀態(tài)發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中血小板的活化程度及其診斷、治療、預(yù)防等具有特別重要的意義。FCM分析血小板膜糖蛋白方法簡(jiǎn)便、快速、標(biāo)本用量少、靈敏度高、特異性強(qiáng)、結(jié)果準(zhǔn)確，為血小板的基礎(chǔ)和臨床研究提供了嶄新的手段。
CD62p(P選擇素)是一種糖蛋白，存在于血小板α顆粒以及內(nèi)皮細(xì)胞中。CD62p在體內(nèi)或體外刺激后，即轉(zhuǎn)移至膜表面，巨核細(xì)胞也有表達(dá)。CD62p又稱GMP—140或PADGEM蛋白(血小板活化依賴α顆粒膜蛋白)，它在血小板與單核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞相互作用中起關(guān)鍵作用。
CD63為溶酶體膜糖蛋白，在多種細(xì)胞的表面和胞漿內(nèi)，尤其是在血小板內(nèi)部都能檢測(cè)到，血小板活化后即轉(zhuǎn)移至膜表面。
測(cè)血小板相關(guān)免疫球蛋白(PAIg)包括抗IgG、IgM、IgA有助于診斷免疫性血小板減少癥。
一些血小板的胞漿中含有核酸物質(zhì)RNA，可被噻唑橙(Thiazole orange,TO)染色稱網(wǎng)織血小板。網(wǎng)織血小板是剛從骨髓中釋放出來(lái)的血小板，可用于血小板減少性疾病的鑒別診斷和療效監(jiān)測(cè)。
3.輔助白血病和淋巴瘤分型和診斷
FCM是血液病MICC分型法中免疫表型分析的重要手段。免疫分型可為臨床指導(dǎo)治療，判斷預(yù)后，預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)提供幫助。
(1)白血病系列分化抗原：
T淋巴細(xì)胞白血。篊D3、CD5、CD7、CD10
B淋巴細(xì)胞白血。篊Dl9、CD20、CD21、CD22，CDl0
NK細(xì)胞白血。篊Dl6、CD56、CD57
粒細(xì)胞白血。篊Dl3、CD33、MPO(髓過(guò)氧化酶)
單核細(xì)胞白血。篊Dl4、CDl5、 CDl1b
紅血。貉吞堑鞍譇(glycophorinA)，CDl3
巨核細(xì)胞白血。篊D41，CD42、CD61
(2)白血病系列非特異性抗原：
CD34+、HLA-DR+、CD38-為干細(xì)胞、CD34+、HLA-DR+、CD38+為原始細(xì)胞，CD34-、HLA-DR-、CD38+為幼稚細(xì)胞。
白血病細(xì)胞系列確定后，可根據(jù)系列抗原表達(dá)特點(diǎn)選擇單抗進(jìn)一步分亞型。
4.HIV和獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)
HIV主要感染CD4+T細(xì)胞，CD4+受體是病毒進(jìn)入的主要途徑。正常血中CD4+T細(xì)胞約1000細(xì)胞/ul(400---1500細(xì)胞/ul)。<400—500細(xì)胞/ul表示病毒強(qiáng)烈影響免疫系統(tǒng)。<200細(xì)胞/ul即使沒(méi)有癥狀可確定AIDS，有預(yù)后價(jià)值。HIV感染早期CD8+T細(xì)胞增多，發(fā)展為AIDS則下降。
5.DNA含量分析以及細(xì)胞分化周期分析
DNA含量檢測(cè)根據(jù)細(xì)胞周期動(dòng)力學(xué)概念，在一個(gè)周期內(nèi)可分為4個(gè)時(shí)相，依次為G1期、S期、G2期和M期，見(jiàn)圖2。利用DNA分析軟件可以確定各時(shí)相細(xì)胞的比例。能夠進(jìn)行DNA含量分析的標(biāo)本可以是PBL，正常、病變或腫瘤組織，針吸或活檢組織，石蠟包埋組織，胸水、腹水，膀胱沖洗液和體外培養(yǎng)細(xì)胞。
DNA含量分析的目的在于確定某一組織或細(xì)胞群體的增殖狀態(tài)，引入DNA指數(shù)(D1)即DNA倍體的概念可以用于區(qū)別腫瘤的良惡性，惡性腫瘤的增殖狀態(tài)。
二倍體細(xì)胞的DI=1，在臨床上二倍體細(xì)胞DI在0.9—1.0之間，根據(jù)DI可以確定細(xì)胞DNA倍體。
6.化療藥物用藥指導(dǎo)，敏感藥物篩選
藥物作用處理后的細(xì)胞采用Calcein-AM(Florescein-methylene aminodiacetic acid 熒光素亞甲亞氨二醋酸)與PI染色。Calcein-AM 為非熒光乙酰甲氨基酯經(jīng)活細(xì)胞非特異性酯酶水解可變?yōu)闊晒饨Y(jié)合物，而死細(xì)胞不能水解因而無(wú)熒光。死細(xì)胞可被PI染成紅色，活細(xì)胞不被PI染色，兩者區(qū)分明顯，可用以篩選藥物。
7.實(shí)體器官移植配型和排異監(jiān)測(cè)
可判斷受者的免疫狀態(tài)、免疫抑制劑療效和全身免疫抑制程度。移植前交叉配型檢測(cè)類抗原的抗體(PRA)、血管內(nèi)皮細(xì)胞抗原(VEA)抗體，可以提高移植成功率。
8.細(xì)胞凋亡(cell apoptosis)檢測(cè)
細(xì)胞凋亡可清除體內(nèi)有害的細(xì)胞群，維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。細(xì)胞凋亡闡明一些疾病的發(fā)病機(jī)制，導(dǎo)致疾病新療法的出現(xiàn)。FCM利用光散射和熒光染色能夠通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞光散射改變、膜結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)運(yùn)功能改變、DNA含量變化和DNA斷裂點(diǎn)標(biāo)記，從多方面分析和鑒定凋亡。是目前能夠同時(shí)區(qū)分凋亡與壞死的唯一手段。
碘化丙啶(P1)標(biāo)記FCM分析時(shí)，在細(xì)胞周期分析圖中表現(xiàn)為G0/G1期峰前的亞G1期(sub-G1)峰。
位于細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸(Ps)，反轉(zhuǎn)至外側(cè)是凋亡早期膜結(jié)構(gòu)的特異性改變。annexin-V是一種Ca2+依賴的磷脂結(jié)合蛋白，與PS具有高親和力，以酶或熒光素標(biāo)記的annexin-V為探針可鑒定凋亡，與PI結(jié)合經(jīng)流式細(xì)胞儀(FCM)分析，是唯一可區(qū)分凋亡早、晚期(如何區(qū)分)與壞死的方法。見(jiàn)圖3。
9.Th1與Th2細(xì)胞及細(xì)胞因子
輔助性T細(xì)胞根據(jù)其產(chǎn)生的細(xì)胞因子及功能的不同可分為Th1與Th2兩大類。Th1細(xì)胞分泌IL-2、IFNγ、主要參與細(xì)胞免疫;Th2細(xì)胞分泌IL-4、IL-5、IL-6及IL-10，主要參與體液免疫。兩者相互調(diào)節(jié)、相互平衡，其平衡失調(diào)與多種疾病有關(guān)。應(yīng)用流式細(xì)胞儀可檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子。
近年來(lái)美國(guó)BD公司提供CBA(Cytometric bead array),采用一系列微珠組合來(lái)捕獲并結(jié)合流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)溶液中被檢測(cè)物質(zhì)的量。此法優(yōu)點(diǎn)為同時(shí)可檢測(cè)多項(xiàng)指標(biāo)如人Th1/Th2 CBA可檢測(cè)IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNFα、IFNγ;人炎癥性細(xì)胞因子CBA可同時(shí)檢測(cè)IL-8、IL-1β、IL-6、IL-10、TNFα、和IL-12。
10.網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)
傳統(tǒng)技術(shù)用煌焦油藍(lán)染料,染色涂片后,光鏡下計(jì)數(shù),方法費(fèi)時(shí)且只計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞,誤差較大。使用噻唑橙(Thiazole Orange, TO)染料,可與核酸形成熒光-核酸復(fù)合物,流式細(xì)胞儀上檢測(cè)50000個(gè)紅細(xì)胞求得百分率與絕對(duì)數(shù),有助于貧血的鑒別
11.造血干祖細(xì)胞檢測(cè)
骨髓移植的適應(yīng)癥主要有白血病、先天性免疫缺陷病、再障等。骨髓移植實(shí)質(zhì)是造血干細(xì)胞的移植。CD34+細(xì)胞常作為多能干細(xì)胞的標(biāo)志。
骨髓移植前檢測(cè)CD34+細(xì)胞是很重要的一個(gè)步驟。樣品經(jīng)抗CD34+熒光抗體染色，可識(shí)別和定量CD34+細(xì)胞。
12.糖皮質(zhì)激素受體(glycocorticoid receptor,GCR)檢測(cè)
測(cè)GCR常用細(xì)胞溶質(zhì)放射配基受體(請(qǐng)確認(rèn))結(jié)合測(cè)定，它可定量，但需細(xì)胞量多、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)。流式細(xì)胞儀可測(cè)淋巴細(xì)胞總GCR，此法雖半定量，但檢測(cè)所需樣品量少。對(duì)長(zhǎng)期激素治療或確定下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)(HPA)軸功能紊亂，評(píng)估細(xì)胞內(nèi)GCR水平有一定價(jià)值。
13.環(huán)氧合酶(Cyclooxygenase,COX)檢測(cè)
環(huán)氧合酶(COX)是花生四烯酸合成前列腺素(PG)的限速酶。它催化產(chǎn)生的PG參與機(jī)體多種生理和病理生理過(guò)程。COX有兩種類型:COX-1和COX-2。COX-1為結(jié)構(gòu)性的“看家基因”產(chǎn)物,在多數(shù)組織細(xì)胞中持續(xù)低濃度表達(dá)，參與維持機(jī)體正常的生理功能。COX-2為可誘導(dǎo)性的，炎癥、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等刺激可使其大量表達(dá)，參與和加重炎癥反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、新生血管形成，促進(jìn)黏附、抑制免疫與抑制細(xì)胞凋亡。應(yīng)用流式細(xì)胞儀可監(jiān)測(cè)人血單核細(xì)胞經(jīng)LPS刺激后COX-2與COX-1的水平。對(duì)炎癥、血栓、腫瘤等病的發(fā)病機(jī)制、療效和預(yù)后判斷均有一定價(jià)值。
近年來(lái)應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)特異性CTL細(xì)胞、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等亦在迅速開(kāi)展。
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