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九節(jié)茶高效液相色譜指紋圖譜分離條件的優(yōu)化

[2012/1/12]

　　【摘要】目的優(yōu)化九節(jié)茶HPLC指紋圖譜分離條件。方法使用色譜柱KromasilC18(250mm×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相為甲醇-0.2%磷酸溶液，柱溫為25℃，流速為0.7ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為340nm，考察九節(jié)茶的最佳梯度洗脫條件。結(jié)果經(jīng)優(yōu)化的分離條件為：0～35min，甲醇由20%線性增至40%;35～65min甲醇由40%增至60%，65～75min甲醇由60%減至20%，75～78min甲醇保持20%，可使主要成分達(dá)到較好的分離。結(jié)論通過(guò)對(duì)九節(jié)茶HPLC指紋圖譜分離條件的優(yōu)化，更有利于控制九節(jié)茶藥材的質(zhì)量。

　　【關(guān)鍵詞】九節(jié)茶高效液相色譜指紋圖譜

　　九節(jié)茶系金粟蘭科植物草珊瑚Sarcandraglabra(Thunb.)Nakai的干燥全草，又名腫節(jié)風(fēng)、接骨金粟蘭、草珊瑚、接骨木，為多年生常綠草本或亞灌木。九節(jié)茶味苦辛、性平、有小毒，有祛風(fēng)通絡(luò)、活血散淤、止血止痛、接骨續(xù)筋之功用[1]，臨床應(yīng)用廣泛，特別是對(duì)呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)的炎癥性疾患具有較高療效，還用于骨傷科疾病及各種癌癥。

　　《中國(guó)藥典》2005年版Ⅰ部對(duì)九節(jié)茶藥材的質(zhì)量控制是采用HPLC測(cè)定其中異嗪皮啶的含量[2]，但是單一指標(biāo)性成分的含量測(cè)定往往難以反映中藥整體質(zhì)量，不能較全面反映中藥品質(zhì)。有文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)九節(jié)茶藥材的指紋圖譜的研究[3，4]，在實(shí)際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)上述指紋圖譜的獲取方法重復(fù)性差。本文擬對(duì)九節(jié)茶的液相色譜指紋圖譜分離條件進(jìn)行優(yōu)化，從而為中藥九節(jié)茶質(zhì)量控制提供更好的方法。

　　1材料與儀器

　　1.1材料九節(jié)茶藥材經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)新藥開(kāi)發(fā)與研究中心高英主任中藥師鑒定為金粟蘭科植物草珊瑚Sarcandraglabra(Thunb.)Nakai的全草;甲醇為色譜純;水為液相用水;其他試劑均為分析純。

　　1.2儀器DionexSummit高效液相色譜儀(P680HPLCPump,ASI-100AutomatedSampledInjector,PDA-100PhtodiodeArrayDetecter,UVD170U,STH585ColumnOven)，Chromeleon數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),KromasilC18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm);超聲波清洗器(SB-5200，中國(guó)船舶工業(yè)總公司第七研究院第七二六研究所);R-114型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(BuCHI，瑞士)。

　　2方法與結(jié)果

　　2.1供試品溶液的制備取藥材粗粉1.0g(過(guò)20目篩)，加水回流提取兩次，每次加水20ml，提取1h，濾過(guò)，合并濾液，蒸干，殘?jiān)D(zhuǎn)移至25ml量瓶中，加80%甲醇約20ml，超聲30min，放至室溫，用甲醇定容，離心，小心吸取上清液，用微孔濾膜過(guò)濾后備用。

　　2.2梯度洗脫條件的優(yōu)化

　　2.2.1優(yōu)化條件Ⅰ經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)，得到以下的初始條件：

　　圖1a條件：0～50min,甲醇由5%線性增至70%;50～60min甲醇由70%增至90%，進(jìn)樣量為10μl，柱溫為25℃，流速為0.7ml/min。其色譜圖(見(jiàn)圖1a)可以看出，主要成分的色譜峰集中于10～30min內(nèi)被洗脫，30～60min內(nèi)未出現(xiàn)色譜峰，表明所有成分均已被洗脫。

　　圖1b條件：0～35min,甲醇由5%線性增至25%;35～60min甲醇由25%增至45%，進(jìn)樣量為10μl，柱溫為25℃，流速為0.7ml/min。色譜圖(見(jiàn)圖1b)可以看出，主要成分的色譜峰集中于20～50min內(nèi)被洗脫，但0～20min內(nèi)幾乎沒(méi)有色譜峰出現(xiàn)，因此需要繼續(xù)優(yōu)化。

　　2.2.2優(yōu)化條件Ⅱ

　　圖2a條件：0～40min,甲醇由10%線性增至30%;40～60min甲醇由30%增至45%，進(jìn)樣量為10μl，柱溫為25℃，流速為0.7ml/min。其色譜圖(見(jiàn)圖2a)可以看出，主要成分的色譜峰集中于5～50min內(nèi)被洗脫，但峰與峰的重疊較大。

　　圖2b條件：0～40min,甲醇由15%線性增至35%;40～60min甲醇由35%增至50%，60～70min甲醇由50%減至15%，70～72min甲醇保持15%，進(jìn)樣量為10μl，柱溫為25℃，流速為0.7ml/min。色譜圖(見(jiàn)圖2b)可以看出，色譜峰的分布有所改善，但峰與峰的分離狀況不理想。

　　圖1優(yōu)化條件Ⅰ的HPLC圖(略)

　　圖2優(yōu)化條件Ⅱ的HPLC圖(略)

　　2.2.3優(yōu)化條件Ⅲ

　　圖3a條件：0～35min,甲醇由17.5%線性增至40%;35～60min甲醇由40%增至60%，60～70min甲醇由60%減至17.5%，70～72min甲醇保持17.5%，進(jìn)樣量為10μl，柱溫為25℃，流速為0.7ml/min。其色譜圖(見(jiàn)圖3a)可以看出，色譜峰之間基本達(dá)到分離，且均勻分布在0～60min內(nèi)，但部分峰有拖尾的現(xiàn)象。

　　圖3b條件：0～35min,甲醇由20%線性增至40%;35～65min甲醇由40%增至60%，65～75min甲醇由60%減至20%，75～78min甲醇保持20%，進(jìn)樣量為10μl，柱溫為25℃，流速為0.7ml/min。色譜圖(見(jiàn)圖3b)可以看出，無(wú)論是色譜峰的分離度、分布均勻性及峰形均與指紋圖譜技術(shù)要求相符合。

　　圖3優(yōu)化條件Ⅲ的HPLC圖(略)

　　2.3方法學(xué)考察為考察分析方法的可靠性，對(duì)其穩(wěn)定性、儀器精密度、實(shí)驗(yàn)方法重現(xiàn)性進(jìn)行考察。

　　2.3.1精密度實(shí)驗(yàn)取供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄指紋圖譜。以保留時(shí)間為49.5min的峰為參照物峰，計(jì)算共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值分別在0.48%～0.92%和1.15%～1.97%之間，符合指紋圖譜要求。

　　2.3.2重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)精密稱取藥材5份，照供試品溶液制備方法制備5份樣品溶液，分別進(jìn)樣并記錄指紋圖譜。以保留時(shí)間為49.5min的峰為參照物峰，共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值分別在0.45%～1.03%和1.41%～2.06%之間，基本符合指紋圖譜要求。

　　2.3.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取供試品溶液分別于0，2，6，12，24h進(jìn)樣分析，記錄色圖譜，以保留時(shí)間為49.5min的峰為參照物峰，計(jì)算共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值分別為0.36%～0.96%和1.20%～2.33%之間，表明樣品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

　　2.3.4不同產(chǎn)地藥材的HPLC圖譜見(jiàn)圖4。

　　圖4不同產(chǎn)地藥材的指紋圖譜(略)

　　3討論

　　3.1流動(dòng)相的選擇九節(jié)茶中的化學(xué)成分有倍半萜及其苷類、黃酮及其苷類、有機(jī)酸類、香豆素類，這些成分多具有一定的極性和酸性[5]。本實(shí)驗(yàn)比較了乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.2%磷酸、乙腈-0.1%醋酸、乙腈-1%醋酸、甲醇-0.1%磷酸、甲醇-0.2%磷酸、甲醇-0.1%醋酸、甲醇-1%醋酸等流動(dòng)相的分離效果。結(jié)果同一條件下甲醇較乙腈對(duì)九節(jié)茶提取物的分離效果較佳，0.2%磷酸溶液較其他酸溶液對(duì)九節(jié)茶提取物的分離效果較佳，因此選擇甲醇和0.2%磷酸作為流動(dòng)相單元。

　　3.2柱溫的選擇在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)柱溫對(duì)分離效果影響較大，同一條件下考察了20，25，30，35℃柱溫對(duì)九節(jié)茶提取物的分離效果的影響，結(jié)果25℃較佳。

　　3.3流速的選擇在同一條件下考察了0.6，0.7，0.8，1.0ml/min流速對(duì)九節(jié)茶提取物的分離效果的影響，結(jié)果0.7ml/min流速的分離效果較佳。

　　3.4檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇選擇340nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)[3]。

　　在進(jìn)行等度洗脫時(shí)，如果溶劑的洗脫能力過(guò)強(qiáng)，則不能把主要成分的色譜峰分開(kāi);溶劑的洗脫能力弱時(shí)，雖然能夠分開(kāi)，但保留時(shí)間太長(zhǎng)、峰形不理想。為了得到分離度好、保留時(shí)間合適、峰形理想的色譜峰，只有選用梯度洗脫。

　　液相色譜條件中的柱溫、流速對(duì)色譜峰的影響不大，因而應(yīng)主要調(diào)整流動(dòng)相的組成、溶劑的比例及梯度陡度，從而使各色譜峰之間達(dá)到較好的分離？疾炝鲃(dòng)相的組成時(shí)，在反相色譜中,甲醇的洗脫強(qiáng)度比乙腈要小，因而甲醇酸水系統(tǒng)色譜峰的峰形和分離度都要好于乙腈酸水系統(tǒng)。同時(shí)磷酸比醋酸的酸性強(qiáng)，對(duì)藥材中的酸性成分電離的抑制性強(qiáng)，選用磷酸可以確保色譜峰不拖尾。

　　經(jīng)實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化條件Ⅲ得出的九節(jié)茶液相色譜圖的分離度、分布均勻性及峰形好，可用來(lái)評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地、品種的九節(jié)茶的指紋圖譜的質(zhì)量差異。