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細(xì)胞凋亡檢測(cè)技術(shù)與方法

[2012/10/12]

　　細(xì)胞凋亡(Apoptosis)，又稱細(xì)胞程序性死亡(PCD: Programmed Cell Death)，是指細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下，遵循自身的程序，自己結(jié)束其生命的過(guò)程。它是一個(gè)主動(dòng)的，高度有序的，基因控制的，一系列酶參與的過(guò)程。細(xì)胞凋亡概念提出至今還不到30年的時(shí)間，但由于它在保證多細(xì)胞生物的健康生存過(guò)程中扮演著關(guān)鍵角色，對(duì)個(gè)體的正常發(fā)育及細(xì)胞凋亡紊亂在病理學(xué)研究中的重要作用，引起了人們對(duì)其機(jī)制和組分的廣泛而深入地研究，成為目前生命科學(xué)界最為熱門話題之一，也是生命科學(xué)界乃至社會(huì)各界爭(zhēng)相投入的研究領(lǐng)域。從近年的SCI排名中我們可以看到，信號(hào)傳導(dǎo)方面的文章遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)位于第二位的人類基因組方面的，而信號(hào)傳導(dǎo)中一個(gè)重要的前沿領(lǐng)域就是細(xì)胞凋亡的研究。隨著這方面研究的持續(xù)升溫，涌現(xiàn)出了大量新的技術(shù)和方法對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測(cè)，其中不少已經(jīng)有商品化的產(chǎn)品出現(xiàn)，大大加速了研究的進(jìn)程。具體來(lái)說(shuō)，針對(duì)凋亡的不同階段有以下一些方法。

　　1. 早期檢測(cè):

　　1) PS(磷脂酰絲氨酸)在細(xì)胞外膜上的檢測(cè):

　　PS從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)轉(zhuǎn)移到外側(cè)在細(xì)胞受到凋亡誘導(dǎo)后不久發(fā)生, 可能作為免疫系統(tǒng)的識(shí)別標(biāo)志。AnnexinV，一個(gè)鈣依賴性的磷脂結(jié)合蛋白，能專一性的結(jié)合暴露在膜外側(cè)的PS，再通過(guò)簡(jiǎn)單的顯色或發(fā)光系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。由于這是一種凋亡早期的活細(xì)胞檢測(cè)(懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞都適用)，可與DNA染料或別的晚期檢測(cè)方法相結(jié)合來(lái)標(biāo)記凋亡的發(fā)展階段。

　　美國(guó)著名生物試劑公司CLONTECH和INTERGEN公司分別開發(fā)了多種標(biāo)記的Annexin V產(chǎn)品，簡(jiǎn)便快速，10分鐘就可完成檢測(cè)。其中帶熒光標(biāo)記的Annexin V-EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein)及Annexin V-FITC，靈敏度高，可作為FACS(流式細(xì)胞分選)方法篩選凋亡細(xì)胞的基礎(chǔ)。由于融合蛋白Annexin V-EGFP，EGFP與PS 的結(jié)合比例為1：1，還可進(jìn)行定量檢測(cè)。除此之外，還提供生物素偶聯(lián)的Annexin V，可通過(guò)常用的酶聯(lián)顯色反應(yīng)來(lái)檢測(cè)。另外，MACS公司將磁珠包被Annexin V，可采用磁分選方法篩選凋亡細(xì)胞。

　　2)細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)改變的檢測(cè)：

　　這反應(yīng)了細(xì)胞凋亡研究中相對(duì)較新的趨勢(shì)，研究什么樣的氧化還原環(huán)境引起下游事件的發(fā)生。CLONTECH公司的ApoAlertTM Glutathione Detection Kit通過(guò)熒光染料monochlorobimane(MCB)體外檢測(cè)凋亡細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中谷光苷肽的減少來(lái)檢測(cè)凋亡早期細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的變化。正常狀態(tài)下,谷光苷肽(glutathione：GSH)作為細(xì)胞的一種重要的氧化還原緩沖劑。細(xì)胞內(nèi)有毒的氧化物通過(guò)被GSH還原而定期去除，氧化型的GSH又可被GSH還原酶迅速還原。這一反應(yīng)在線粒體中尤為重要，許多呼吸作用中副產(chǎn)物的氧化損傷將由此被去除。在Jurcat和一些其它類型的細(xì)胞中，細(xì)胞膜中有可被凋亡信號(hào)啟動(dòng)的ATP依賴的GSH轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)GSH的排除非；钴S時(shí)，細(xì)胞液就由還原環(huán)境轉(zhuǎn)為氧化環(huán)境，這可能導(dǎo)致了凋亡早期細(xì)胞線粒體膜電位的降低，從而使細(xì)胞色素C(三羧酸循環(huán)中的重要組分)從線粒體內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞液中，啟動(dòng)凋亡效應(yīng)器caspase的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。

　　由于 GSH與氧化還原作用及線粒體功能密切相關(guān)，此項(xiàng)檢測(cè)除了對(duì)研究細(xì)胞凋亡的起始非常有用外，還可用于心臟病、中風(fēng)等疾病治療的研究。但有些細(xì)胞如：HeLa 和3T3細(xì)胞凋亡時(shí)沒有明顯的GSH水平的變化，不能用此法檢測(cè)。

　　3)細(xì)胞色素C的定位檢測(cè)

　　細(xì)胞色素C作為一種信號(hào)物質(zhì)，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用。正常情況下，它存在于線粒體內(nèi)膜和外膜之間的腔中，凋亡信號(hào)刺激使其從線粒體釋放至細(xì)胞液，結(jié)合Apaf-1 (apoptotic protease activating factor-1)后啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)：細(xì)胞色素C/Apaf-1復(fù)合物激活caspase-9，后者再激活caspase-3和其它下游caspase。細(xì)胞色素C氧化酶亞單位Ⅳ(cytochrome c oxidase subunit Ⅳ：COX4)是定位在線粒體內(nèi)膜上的膜蛋白，凋亡發(fā)生時(shí)，它保留在線粒體內(nèi)，因而它是線粒體富集部分的一個(gè)非常有用的標(biāo)志。

　　ApoAlertTMCell Fractionation Kit不用超離心，可從凋亡和非凋亡細(xì)胞中快速有效分離出高度富集的線粒體部分，再進(jìn)一步通過(guò)Western雜交用細(xì)胞色素C抗體和COX4抗體標(biāo)示細(xì)胞色素C和COX4的存在位置，從而判斷凋亡的發(fā)生。

　　4) 線粒體膜電位變化的檢測(cè)：

　　在凋亡研究的早期，從形態(tài)學(xué)觀測(cè)上線粒體沒有明顯的變化。隨著凋亡機(jī)制研究的深入，發(fā)現(xiàn)線粒體凋亡也是細(xì)胞凋亡的重要組成部分，發(fā)生很多生理生化變化。例如，在受到凋亡誘導(dǎo)后線粒體轉(zhuǎn)膜電位會(huì)發(fā)生變化，導(dǎo)致膜穿透性的改變。MitoSensorTM，一個(gè)陽(yáng)離子性的染色劑，對(duì)此改變非常敏感，呈現(xiàn)出不同的熒光染色。正常細(xì)胞中，它在線粒體中形成聚集體，發(fā)出強(qiáng)烈的紅色熒光。凋亡細(xì)胞中，因線粒體穿膜電位的改變，它以單體形式存在于細(xì)胞液中，發(fā)出綠色熒光。用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可清楚地分辨這兩種不同的熒光信號(hào)。CLONTECH公司的ApoAlert Mitochondrial Membrane Sensor Kit就采用這種原理來(lái)檢測(cè)線粒體膜電位的變化。但是，這種方法不能區(qū)分細(xì)胞凋亡或其他原因?qū)е碌木粒體膜電位的變化。

　　2. 晚期檢測(cè)：

　　細(xì)胞凋亡晚期中，核酸內(nèi)切酶(某些Caspase的底物)在核小體之間剪切核DNA，產(chǎn)生大量長(zhǎng)度在180-200 bp 的DNA片段。對(duì)于這一現(xiàn)象的檢測(cè)通常有以下兩種方法：

　　1) TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling)

　　通過(guò)DNA末端轉(zhuǎn)移酶將帶標(biāo)記的 dNTP (多為dUTP)間接(通過(guò)地高辛)或直接接到DNA片段的3’-OH端，再通過(guò)酶聯(lián)顯色或熒光檢測(cè)定量分析結(jié)果。美國(guó)Intergen公司提供多種標(biāo)記方法，直接熒光標(biāo)記，地高辛介導(dǎo)熒光標(biāo)記或過(guò)氧化物酶聯(lián)顯色，可做細(xì)胞懸液、福爾馬林固定或石蠟處理的組織、細(xì)胞培養(yǎng)物等多種樣本的檢測(cè)。其中，直接標(biāo)記步驟少，操作簡(jiǎn)便。而間接標(biāo)記有信號(hào)放大的作用，檢測(cè)靈敏度高。

　　2) LM-PCR Ladder (連接介導(dǎo)的PCR檢測(cè))

　　當(dāng)?shù)蛲黾?xì)胞比例較小以及檢測(cè)樣品量很少(如活體組織切片)時(shí)，直接瓊脂糖電泳可能觀察不到核DNA的變化。CLONTECH公司的ApoAlert?LM-PCR Ladder Assay Kit通過(guò)LM-PCR(ligation-mediated PCR),連上特異性接頭，專一性地?cái)U(kuò)增核小體的梯度片段，從而靈敏地檢測(cè)凋亡時(shí)產(chǎn)生的核小體的梯度片段。此外，LM-PCR 檢測(cè)是半定量的，因此相同凋亡程度的不同樣品可進(jìn)行比較。

　　上述兩種方法都針對(duì)細(xì)胞凋亡晚期核DNA斷裂這一特征，但細(xì)胞受到其它損傷(如機(jī)械損傷，紫外線等)也會(huì)產(chǎn)生這一現(xiàn)象，因此它對(duì)細(xì)胞凋亡的檢測(cè)會(huì)受到其它原因的干擾。

　　3) Telemerase Detection (端粒酶檢測(cè))

　　這是相對(duì)來(lái)說(shuō)推出較早，用得較多的一種方法。端粒酶是由RNA和蛋白組成的核蛋白，它可以自身RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成端粒區(qū)重復(fù)序列，使細(xì)胞獲得“永生化”。正常體細(xì)胞是沒有端粒酶活性的，每分裂一次，染色體的端粒會(huì)縮短，這可能作為有絲分裂的一種時(shí)鐘，表明細(xì)胞年齡、復(fù)制衰老或細(xì)胞凋亡的信號(hào)。研究發(fā)現(xiàn)，90%以上的癌細(xì)胞或凋亡細(xì)胞都具有端粒酶的活性。Intergen公司的TRAP-eze Telemerase Detection Kit在1996年率先推出。它提供特定的寡核苷酸底物，分別與底物及端粒重復(fù)序列配對(duì)的引物。如果待測(cè)樣本中含有端粒酶活性，就能在底物上接上不同個(gè)數(shù)的6堿基(GGTTAG)端粒重復(fù)序列，通過(guò)PCR反應(yīng)，產(chǎn)物電泳檢測(cè)就可觀察到相差六個(gè)堿基的DNA Ladder現(xiàn)象(參見圖4)。此外，Intergen公司還提供用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測(cè)的試劑盒.

　　同樣，這種檢測(cè)方法也不專對(duì)細(xì)胞凋亡，檢測(cè)結(jié)果也不純反應(yīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

　　3.mRNA水平的檢測(cè)

　　研究者們發(fā)現(xiàn)了很多在細(xì)胞凋亡時(shí)表達(dá)異常的基因，檢測(cè)這些特異基因的表達(dá)水平也成為檢測(cè)細(xì)胞凋亡的一種常用方法。據(jù)報(bào)道，F(xiàn)as 蛋白結(jié)合受體后能誘導(dǎo)癌細(xì)胞中的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxic T cells)等靶細(xì)胞。Bcl-2 和bcl-X (長(zhǎng)的) 作為抗凋亡(bcl-2 和bcl-X)的調(diào)節(jié)物，它們的表達(dá)水平比例決定了細(xì)胞是凋亡還是存活。一般多采用Northern雜交和RT-PCR走膠對(duì)它們進(jìn)行檢測(cè)。隨著近年來(lái)熒光定量PCR技術(shù)的發(fā)展，用定量PCR技術(shù)來(lái)檢測(cè)基因表達(dá)水平無(wú)疑比之前者更快更準(zhǔn)確。Intergen公司的Amplifluor? Apoptosis Gene Systems就根據(jù)這一新技術(shù)原理，通過(guò)檢測(cè)fas, bax-alpha 和 bcl-X (長(zhǎng)的) 基因的 mRNA表達(dá)水平來(lái)進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測(cè)。

　　以上介紹了針對(duì)凋亡不同階段特征的檢測(cè)方法，隨著凋亡機(jī)制研究的深入，近年來(lái)還發(fā)展了許多針對(duì)特定的凋亡途徑的檢測(cè)，如抗體法，酶活性測(cè)定等等，Cell Signeling technology公司，DAKO公司，Santa-Cruz公司，Calbiochem & Oncogene公司都緊跟科研潮流，開發(fā)了大量的抗體及活性測(cè)定產(chǎn)品。我們將陸續(xù)報(bào)道這方面的技術(shù)方法與產(chǎn)品。