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電生理基本技術(shù)

[2012/10/13]

　　一.電刺激。

　　二.生物放大器：正確選擇，植物性神經(jīng)沖動幅度多為50-100μV。不同組織，應(yīng)采用不同的參 數(shù)。如

　　ECG：振幅0.1-2mV, 靈敏度0.5-1mV，時間常數(shù)0.1-1.0s，高頻濾波1KHz植物性神經(jīng)沖動：振幅50-150μV, 靈敏度25-100μV，時間常數(shù)0.01-0.1s，高頻濾波3-5KHz

　　中樞神經(jīng)元單位放電：振幅100-300μV,靈敏度50-100μV，時間常數(shù)0.01-0.1s，高頻濾波5-10KHz

　　三.玻璃微電極：

　　常用尖端0.5-5μm，向細胞內(nèi)插入時，需小于0.5μm(細胞直徑的1/10~1/100)，且尖端的傾斜度應(yīng)相當緩和，一般微電極可分為金屬微電極和玻璃微電極兩類。

　　金屬微電極，現(xiàn)多用鍍鉑鎢絲電極(platinum-plated tungsten electrode)，在鎢絲上鍍鉑，可極大改善電極的電學(xué)特性，噪聲可大大降低，加之機械強度大，適合長期體外記錄(paréD， Gaudreau H. Projection cells and interneurons of thelateral and basolateral amygdala: distinct firing patterns and differential relation to the thera and delta rhythms in conscious cats. J Neursci, 1996,16(10):3334-3350

　　現(xiàn)要也常用鍍銀碳纖維電極。玻璃微電極記錄易受機械位移的影響，加之尖端的電解質(zhì)會漏出或堵塞，不適合半小時以上的長時間記錄，玻璃微電極可分單管和多管微電極。

　　毛坯管在國外多用Pyrex管，國內(nèi)多用GG-17和95料玻管。細胞外記錄多采用外徑1.5-2mm玻璃，細胞內(nèi)記錄則采用外徑1mm細玻管，內(nèi)外徑之比約為2：3或5：6，長6-8cm。拉制前必須經(jīng)過清潔處理。

　　清潔液：用等量的(250ml)王水(可反復(fù)應(yīng)用)。一般毛坯管捆成把放入清潔液中1-2h，取出自來水沖洗20-30min，再放入無水酒精中洗滌，再放入盛滿蒸餾水燒杯中加熱煮沸10min，倒去蒸餾水，再換新蒸餾水反復(fù)3次，再放入烤箱中烤干，備用，切不可用市售的洗滌劑，以防降低電極充灌液的表面張力而影響沖灌。

　　充灌液常用3mol/L KCl，為避免Cl-擴散，也可用2mol/L醋酸鉀或檸檬酸鉀充灌，也有人用0.5-1mol/L

　　NaCl(低濃度)充灌可降低噪音。細胞外記錄時，最后再用3-4mol/L NaCl +2%旁胺天藍溶液定位。在膜片鉗中還常加鈣螯合劑，如EGTA。阻抗與不同組織相關(guān)。

　　四.電生理實驗中噪聲和干擾的形成和排除。

　　(一)來源。

　　1.干擾信號與生物電生理信號的鑒別。準確區(qū)分生物電信號與干擾的偽跡是電生理實驗的先決條件。

　　2.來源。主要有三個方面：

　　其一。物理性干擾。1)靜電和電磁的干擾：實驗室附近高壓電，室內(nèi)日光燈可產(chǎn)生50Hz的靜電干擾，尤其是交流電，尤其是50Hz頻率干擾最大(電子設(shè)備為50Hz)。其特點是幅度大，波形規(guī)則。2)噪聲干擾：電子元件本身產(chǎn)生雜亂無章電壓和電流稱噪聲，一般與放大器內(nèi)部元件的質(zhì)量與性能有關(guān)。

　　其二。接地不良。1)地線電阻應(yīng)小。2)儀器故障。產(chǎn)生漏電電流，在地線上形成電位差，產(chǎn)生干擾。3)地線行走過程中打圈，形成線圈，易接受電場和磁場的干擾。4)各儀器設(shè)備應(yīng)采用一點接地的方式，若采用多點接地，形成大地回路，也會引起干擾。5)地線過長與電源線形成交流環(huán)路。6)誤用市電三孔中性線作為大地線(中性線上有4-5A電流)。

　　其三。生理性干擾。1)大腦電活動時，眨眼、眼球運動均對腦電具有干擾作用。2)實驗中環(huán)境溫度過低，動物寒戰(zhàn)、抖動，引起肌電的發(fā)放而干擾記錄，或因呼吸運動引起記錄部位機械位移引起干擾信號。3)心電干擾，頻率與心電一致。

　　(二)排除。

　　1.物理性干擾。1)屏蔽法：用于低頻電和靜電干擾，屏蔽線分布電容較大，線與線之間不可平行排列，更不可為了美觀而將多線扎在一起，這會加大分布電容，易偶合高頻干擾噪聲。2)遠離法。3)改變位置法。依電流方向相反，產(chǎn)生反向磁場的原理，改變各個儀器的位置或放大器輸入的方位，會使干擾磁場抵消，微電極放大器探頭阻抗高，易引入干擾，實驗前可反復(fù)調(diào)整其方向和位置。4)微電極記錄時盡量減少微電極本身的阻抗，減少輸入阻抗及干擾信號在這個阻抗上形成干擾電壓降，微電極到探頭的連線<5cm。5)用監(jiān)聽噪聲，以便及時排除。

　　2.儀器質(zhì)量，盡量改進。

　　3.接地不良。地線應(yīng)盡量短粗，不能與電源線平行或打圈，不 要接在電源線的中性線

　　上，地線單獨埋設(shè)，埋置處應(yīng)較潮濕，附近無大型變壓電動機，并在坑內(nèi)加些食鹽。

　　4.檢查各儀器 是否漏電。

　　5.慢生物電變化時用乏極化電極，實驗對象宜安靜，勿受振動。

　　(三)刺激偽跡過大及防止。1)盡量減少刺激脈沖的波寬和強度。2)在動物體或標本上，盡量延長刺激部位的距離，在刺激電極和引導(dǎo)電極之間加一接地電極，此電極離引導(dǎo)電極愈近，刺激偽跡就越小;采用變換刺激極性，結(jié)合疊加處理，可抵消偽跡。

　　注：微電極中高濃度充灌液易蒸發(fā)，造成電極回路的開路，因此常在微電極插入Ag-AgCl絲或鉑金絲后，在微電極尾部開口處涂上一層凡士林，防止水分蒸發(fā)。

　　動物麻醉和制動下，體溫會下降，故應(yīng)保溫調(diào)節(jié)，加溫維持肛溫36-38℃.

　　記錄脊髓背角或腹角神經(jīng)元將脊柱前后拉直以減小呼吸運動造成的位移。記錄腦神經(jīng)元應(yīng)在表面用溫熱石蠟制成一油槽，防止血管博動和呼吸運動的影響。

　　五.細胞內(nèi)微電極記錄

　　多用幼年離體標本，其原因：1)幼年動物骨骼骨化不完全，結(jié)締組織少，神經(jīng)組織易于分離，標本耐缺氧能力強，有的標本可存活數(shù)小時至數(shù)天，但標本也可能發(fā)育不完全，如背根和腦干到脊髓的投射纖維要到三周動物才完全。神經(jīng)纖維髓鞘化不全，其藥理作用與成年動物也不同。從實驗角度上講，脊髓背腹根短，不利于電生理刺激記錄。小鼠一般應(yīng)小于15g，制備標本才

　　有可能成功，而這樣小鼠背腹根神經(jīng)節(jié)不利于電生理實驗。最適合的動物是金黃地鼠(hamster)，介于大小鼠之間，制備標本活性很好，可能與其冬眠習(xí)性有關(guān)，而且其脊髓背腹根長達20-25mm，利于電生理記錄。動物選擇仍依實驗而定，同一標本，不同中樞結(jié)構(gòu)對缺氧耐受力也不同。金黃地鼠，若觀察脊髓背角神經(jīng)元活動，可用150-160g體重的鼠均可，但要研究腹角神經(jīng)元，則體重不宜超過30g。離體標本的灌流注，如ACSF。其中緩沖液成分有兩種，一是重碳酸鹽(bicarbonate)：溫度低(4℃)，配方有利于降低組織興奮性。二是磷酸鹽緩沖液和HEPES緩沖液：其優(yōu)點是接近于人體環(huán)境。各種緩沖液一般都先配母液，臨用前一天，或臨用前稀釋。