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轉(zhuǎn)錄分析的幾種方法

[2012/10/16]

　　信號通路，只有一個目的：將細(xì)胞的外部信號轉(zhuǎn)換成細(xì)胞的內(nèi)部變化。不管是胰島素，還是異亮氨酸，抗原還是腎上腺素，它們的終極目的總是如出一則：對轉(zhuǎn)錄活性的改變。

　　這些對于轉(zhuǎn)錄活性的影響來自于轉(zhuǎn)錄因子與基因的調(diào)控區(qū)域：如啟動子、增強(qiáng)子、沉默子等結(jié)合達(dá)到的。經(jīng)典的凝膠遷移滯后試驗(the electrophoretic mobility shift assay)已經(jīng)成為證明某種蛋白能與特定的短基因序列結(jié)合的有力方法手段。但是凝膠遷移滯后試驗具有速度慢，通量低，不定量和具有放射性的特點(diǎn)。即使完了你還不知道究竟是何種蛋白或者是蛋白的何種基團(tuán)負(fù)責(zé)指導(dǎo)體內(nèi)轉(zhuǎn)錄的變化。

　　為了弄清楚蛋白與基因序列結(jié)合的精確位點(diǎn)，需要利用基于抗體的實(shí)驗。目前已經(jīng)有了一些方便快捷的分析試劑，可以有力的幫助進(jìn)行轉(zhuǎn)錄研究分析，其中有一些適用于發(fā)現(xiàn)型(篩選多種因子)，有一些用于證實(shí)猜想的。當(dāng)然這些總是從初期的工作，進(jìn)入精細(xì)進(jìn)一步的研究工作。

　　PROTEIN ARRAYS(蛋白芯片)

　　What they are：固定的轉(zhuǎn)錄因子陣列，利用標(biāo)記的基因序列或者蛋白質(zhì)進(jìn)行探索。

　　What to use them for：用于發(fā)現(xiàn)和證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)或者蛋白-蛋白相互作用。

　　Pros(優(yōu)點(diǎn))：能提供一種在廣泛的因子中檢測與特定序列結(jié)合的因子。

　　Cons(缺點(diǎn))：可能會錯失一些同源因子和一些轉(zhuǎn)錄后的變化。

　　Things to keep in mind：蛋白分析提供了一種在DNA片段中篩選潛在的結(jié)合位點(diǎn)的方法。但這種方法缺乏柔韌性，因此只局限于廣泛的已研究的因子。

　　Available kits：

　　Panomics的 TF Protein Array I for DNA-Protein Interactions (48 proteins, Catalog No. MA3505, $863),

　　Active Motif的 TransArray (38 proteins, two membranes, Catalog No. 31400, $580)。

　　MICROSPHERE ASSAYS(液相芯片)

　　What they are：一些微磁珠的集合在一起，每一個能與唯一的因子結(jié)合位點(diǎn)偶聯(lián)。

　　What to use them for：篩選轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)

　　Pros(優(yōu)點(diǎn))：提供一種廣泛相對無偏見的第一次篩選手段，理論上，一次能檢測100種不同轉(zhuǎn)錄因子。

　　Cons(缺點(diǎn))：需要特定的硬件設(shè)施(如Luminex reader)，不能完全的解釋哪一種蛋白與哪一種蛋白結(jié)合。

　　Things to keep in mind：像RNAse保護(hù)試驗一樣，磁珠系統(tǒng)能定量轉(zhuǎn)錄因子保護(hù)寡核苷酸不被消化的能力。來自匹茲堡大學(xué)醫(yī)學(xué)中心Luminex core facility主任Anna Lokshin就表示：“這種微粒方法能得到意想不到的結(jié)果，因為它不會受到假說和初步數(shù)據(jù)的影響”，“通常你會在自己的知識領(lǐng)域里尋找，但是各自的知識領(lǐng)域是受到限制的。”

　　Available kits：

　　Invitrogen的 BioSource 3-plex Transcription Factor Assays (100 tests, Catalog No. LHF2041, $845),

　　Marligen Biosciences的 Multiplex Transcription Factor Profiling Kit (20-plex) (96 reactions, Catalog No. 11954-096, Price $2,899).

　　CHROMATIN IMMUNOPRECIPITATION(染色質(zhì)免疫沉淀分析)

　　What they are：來自天然染色質(zhì)的蛋白質(zhì)-DNA交聯(lián)復(fù)合物的免疫沉淀，通過PCR或者微陣列來分析。

　　What to use them for：證實(shí)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)-DNA天然結(jié)合的細(xì)節(jié)。

　　Pros(優(yōu)點(diǎn))：是能在體內(nèi)進(jìn)行的唯一分析方法，能詳細(xì)解釋蛋白容量的變化。

　　Cons(缺點(diǎn))：需要一種目的轉(zhuǎn)錄因子的抗體。同時ChIP相對于凝膠遷移滯后試驗來說，更為復(fù)雜和困難。

　　Things to keep in mind：ChIP不能說明白一種特定結(jié)合是否是功能性的。因此，我們需要利用轉(zhuǎn)錄活化分析方法。ChIP很有用，但是需要與其他技術(shù)合用來解決整個難題。

　　Available kits：

　　Active Motif的 ChIP-IT (25 reactions, Catalog No. 53001, $395),

　　Upstate的 EZ ChIP (22 reactions, Catalog No. 17-371, Price $329)。

　　OLIGONUCLEOTIDE ARRAYS(寡核苷酸芯片)

　　What they are：固定的寡核苷酸結(jié)合位點(diǎn)陣列，一般用于探測核提取物和研發(fā)某種蛋白的抗體。

　　What to use them for：篩選轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)物。

　　Pros(優(yōu)點(diǎn))：提供一種相對廣泛，無偏見的第一次篩選手段。

　　Cons(缺點(diǎn))：定性分析，需要進(jìn)行研究的轉(zhuǎn)錄因子對象的抗體。

　　Things to keep in mind：不同的實(shí)驗中存在著差異

　　Available kits：

　　Panomics的 Protein/DNA Combo Array (345 sites, Catalog No. MA1215, $1,415),

　　ArrayIt Transcription Factor Microarrays (expected Fall 2006, estimated price $600-$900)。

　　ELISA-BASED ASSAYS(ELISA分析)

　　What they are：基于酶聯(lián)免疫反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合分析。

　　What to use them for：定量轉(zhuǎn)錄因子的濃度。

　　Pros(優(yōu)點(diǎn))：具有快速，定量和高通量的特點(diǎn)。

　　Cons(缺點(diǎn))：需要目的轉(zhuǎn)錄因子的一種抗體才能進(jìn)行試驗。

　　Things to keep in mind：ELISA-based assays可以比傳統(tǒng)的凝膠遷移分析容納更多的蛋白，并且能將信號放大。具有半定量的特點(diǎn)。

　　Available kits：

　　Clontech的 TransFactor STAT3 Colorimetric Kit (1 x 96 assays, Catalog No. 631953, $583),

　　Panomics的 HIF ELISA Kit (1 x 96 assays, Catalog No. EK1020, $518),

　　Active Motif的 TransAM CREB Kit (1 x 96 assays, Catalog No. 42096, $585)。