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二抗的選擇和定位

[2012/11/27]

　　第一步：選擇抗體。

　　三種二抗抗體：Whole IgG，F(xiàn)(ab&;rsquo;)2片段，F(xiàn)ab片段。

　　Whole IgG抗體適用于多數(shù)情況，是性價比最高的。Whole IgG是完整的抗體分子，有一個Fc部分和兩個與抗原結(jié)合的Fab部分 (Figure 1, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc網(wǎng)站)。

　　F(ab&;rsquo;)2片段抗體是胃蛋白酶消化IgG除去Fc部分，剩下靠二硫鍵連接的結(jié)合抗原的兩個Fab部分。F(ab&;rsquo;)2片段抗體用在避免抗體與Protain A 或G結(jié)合，或者與有Fc受體的活細胞結(jié)合。如果一抗是完整的抗體分子，不管二抗是哪種形式都可能結(jié)合Fc受體。

　　Fab片段抗體是用木瓜蛋白酶消化IgG后得到的。這些抗體只含有一個Fab結(jié)合位點。它們用來封閉內(nèi)源性的免疫球蛋白，或者在使用相同物種來源的一抗多標記的實驗中封閉暴露的免疫球蛋白。

　　第二步：一抗的物種來源。

　　為了正確的選擇二抗，必須知道一抗的物種來源。如果一抗是小鼠來源的，就找&;ldquo;anti-mouse&;rdquo;。

　　第三步：選擇二抗的物種來源。

　　第四步：選擇二抗的特異性。

　　因為不同物種來源的免疫球蛋白含有相似的結(jié)構(gòu)，抗一個物種的抗體可能與其他物種發(fā)生交叉反應(yīng)，除非事先特殊處理過(如標有&;ldquo;min X Hu, Bov&;hellip;Sr Prot&;rdquo; - minimal cross-reactivity to human and bovine serum proteins) ), 經(jīng)過用圓括號中的物種 (human, bovine) 的血清蛋白的吸附處理來降低交叉反應(yīng))。在選擇二抗時，只有在來自兩個很相近的物種的一抗都存在而需要檢測其中一種時，才使用針對其中一種特殊吸附處理過的抗體。這樣的抗體可能不能和所有亞型的IgG都很好的反應(yīng)。比如，在含有內(nèi)源性免疫球蛋白的大鼠的組織樣本中，使用針對大鼠吸附處理過的anti-mouse IgG來檢測小鼠的一抗，或者在多標記實驗中使用了大鼠的一抗時。當不含有大鼠免疫球蛋白時，最好采用沒有針對大鼠IgG處理過的anti-mouse二抗來檢測小鼠的一抗。牛血清白蛋白(BSA)和奶粉中可能含有牛IgG。直接針對牛，山羊，馬和綿羊的二抗會跟牛IgG反應(yīng)。因此，使用BSA或者奶粉來封閉或者稀釋這些抗體可能導(dǎo)致背景染色明顯增加，以及抗體效價的降低。這時，推薦使用5%的二抗來源物種的正常血清來封閉。

　　Anti-IgG (H+L)這類抗體和IgG分子的重鏈和輕鏈[比如Fc和F(ab&;rsquo;)2/Fab部分]都可以反應(yīng)。也可以和其他的免疫球蛋白家族(比如IgM和IgA)反應(yīng)，因為所有的免疫球蛋白都有相同的輕鏈(&;kappa;鏈或者&;lambda;鏈)。Anti-IgG (H+L) 比只抗片段的抗體識別更多的抗原表位。

　　Anti-IgG，F(xiàn)c fragment specific這類抗體和IgG重鏈的Fc部分反應(yīng)。它們通過了ELISA檢測，和(或)針對Fab片段吸附的測試。某些情況下，需要額外檢測和處理來降低和IgM或IgA的交叉反應(yīng)，會被描述為&;ldquo;Anti-IgG, Fc&;gamma;fragment specific&;rdquo;。注意：不是所有anti-IgG, Fc抗體和所有亞型的IgG反應(yīng)能力一致。要找和四種IgG亞類反應(yīng)能力差不多的anti-mouse IgG, Fc&;gamma;抗體的話，應(yīng)當選Goat Anti-Mouse IgG (subclasses 1+2a+2b+3), Fc&;gamma;fragment specific (min X Hu,Bov,Rb Sr Prot)。

　　Anti-IgG，F(xiàn)c&;gamma; Subclass specific抗體分別和不同的小鼠IgG亞型重鏈的Fc部分反應(yīng)。這類抗體經(jīng)過ELISA和/或針對Fab片段、IgM和其他小鼠IgG亞型的吸附測試。

　　Anti-IgG，F(xiàn)(ab&;rsquo;)2 fragment specific和IgG的F(ab&;rsquo;)2/Fab部分反應(yīng)。這類抗體經(jīng)過了ELISA和/或Fc片段的吸附檢測。因為和輕鏈反應(yīng)，它們同時也和具有相同輕鏈的其他種類的免疫球蛋白反應(yīng)(如IgM和IgA)。

　　(min X&;hellip;Sr Prot)這類抗體經(jīng)過了檢測，以及針對IgG和圓括號中的物種的血清蛋白的吸附處理。當其他物種免疫球蛋白的出現(xiàn)可能導(dǎo)致交叉反應(yīng)時，推薦使用這類抗體。但是，當要選擇經(jīng)過針對相近物種吸附處理的抗體時，要特別注意，因為它們能識別的表位數(shù)量大大減小了，可能識別單抗的能力很弱。這種情況的例子有Anti-Mouse IgG (min X Rat,&;hellip;.Sr Prot), Anti-Rat IgG (min X Mouse, &;hellip;Sr Prot), 和 Anti-Ramenian Hamster IgG (min X Mouse, Rat, &;hellip;Sr Prot)。

　　ML (Multiple Labeling多標記實驗): 有些抗體標明了ML，來強調(diào)它們除了可以用于單標，還可用于多標記實驗。

　　第五步：選擇需要的探針。

　　第六步：選擇的抗體的規(guī)格、價錢和目錄號。