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高效液相色譜實(shí)驗(yàn)技術(shù)問(wèn)題解答

[2012/12/26]

　　高效液相色譜以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。

　　1、高效液相色譜是如何實(shí)現(xiàn)高效、快速、靈敏的? 解：氣相色譜理論和技術(shù)上的成就為液相色譜的發(fā)展創(chuàng)造條件，從它的高效、高速和高靈敏渡得到啟發(fā)，采用5一10四微粒出定相以提高柱效，采用高壓泵加快液體流動(dòng)相的流速;設(shè)計(jì)高靈敏度、死體積小的紫外、熒光等檢測(cè)器，提高檢測(cè)靈敏度，克服經(jīng)典液相色譜曲缺點(diǎn)，從而達(dá)到高效、快速、靈敏。

　　2、與氣相色譜法相比高效液相色譜有哪些優(yōu)點(diǎn)和不足? 解：氣相色譜的分析對(duì)象是在校溫下具有一定的揮發(fā)性、對(duì)熱穩(wěn)定購(gòu)物質(zhì)。因此它只限于分析氣體和沸點(diǎn)低的化合物或揮發(fā)性的衍生物。而高效液相色譜由于以液體作為流動(dòng)相，只要被分析的物質(zhì)在選用的流動(dòng)相中有一定的按解度，便可以分析，所以適用性廣，不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，特別適合于那些沸點(diǎn)高、極性強(qiáng)、熱穩(wěn)定性差的化合物，例如，生化物質(zhì)和藥物、離子型化合物、熱穩(wěn)定性差的天然產(chǎn)物等。在目前已知的有機(jī)化臺(tái)物中， 只有20%樣品可不經(jīng)化學(xué)處理而能滿意地用氣相色譜分離，80%的有機(jī)化合物要用高效液相色譜分析。

　　氣相色譜中流動(dòng)相是惰性的，它對(duì)組分沒(méi)有作用力，僅起運(yùn)載作用、而高效液相色譜的流動(dòng)相不僅起運(yùn)載作用，而且流動(dòng)相對(duì)組分有一定親合力，可以通過(guò)改變流動(dòng)相種類(lèi)和組成提高分離的選擇性，另外可作流動(dòng)相的化合物多，選擇余地廣。

　　與氣相色譜相比，高效液相色譜的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是樣品的回收比較容易，只要開(kāi)口容器放在柱子末端，就可以很容易地將所分離的各組分收集。回收是定量的，可以用來(lái)提純和制備具有足夠純度的單一物質(zhì)。

　　高效液相色譜不足的是，日前檢測(cè)器的靈敏度不及氣相色譜。必須特別注意“柱外效應(yīng)”對(duì)柱效率及色譜分離的影響。

　　3、試比較氣相色譜與液相色譜的H-u曲線，分析產(chǎn)生不同的原因。

　　解：從圖可看出，氣相色譜和液相色譜得到的H-u曲線，形狀迥然不同，流動(dòng)相的流速對(duì)柱效的影響也不一樣，在氣相色譜的H-u曲線上，塔板高度H隨u變化呈雙曲線.曲線有一最低點(diǎn)，這時(shí)柱效最高，板高最小，流速最佳。而液相色譜H-u曲線，未出現(xiàn)流速降低板高增加的現(xiàn)象，由于最佳流速趨近于零，一般觀察不到最低板高相對(duì)應(yīng)的最佳流速。在正常的情況下，流速降低，板高H總是降低的，這與氣相色譜明顯不同。在氣相色譜中流動(dòng)相流速增大，柱效呈直線降低，而在液相色譜中，流動(dòng)相流速增大，柱效平緩降低。其主要原因是液相色譜的流動(dòng)相為液體，液相的擴(kuò)散系數(shù)Dm很小，通常僅為氣相擴(kuò)散系數(shù)的104~105分之一，所以分子擴(kuò)散項(xiàng)在低u時(shí)也不起多大作用、因此液相色譜H-u曲線未能出現(xiàn)流速降低，板高增加現(xiàn)象。到高速時(shí)，雖然柱內(nèi)線速提高，但固定相和流動(dòng)相的傳質(zhì)都能很快進(jìn)行，故H-u曲線上升緩慢。

　　4、簡(jiǎn)述液相色譜中引起色譜峰擴(kuò)展的主要因素，如何減少諳帶擴(kuò)張、提高柱效? 解：液相色譜中引起色諾峰擴(kuò)展的主要因素為渦流擴(kuò)散、流動(dòng)相傳質(zhì)、停留流動(dòng)相傳質(zhì)及柱外效應(yīng)。

　　在液相色譜中要減小譜帶擴(kuò)張，提高柱效，要減少續(xù)料顆粒直徑，減小境料孔穴深度，提高裝填的均勻性，采用低粘度溶劑作流動(dòng)相，流速盡可能低，同時(shí)要盡可能采用死體積較小的進(jìn)樣器、檢測(cè)器、接頭和傳輸管線等。

　　5、為什么要提出折合參數(shù)?有何特點(diǎn)? 解：我們知道色譜操作條件對(duì)板高是有影響的.Giddings發(fā)現(xiàn)，固定相相同，填充良好，共是粒度dp不同，因而H-u曲線不同，在液相色譜中，培板高度是粒度的函數(shù)，為了比較不向色譜條件下的板高H.提出折合參數(shù)，包括折合板高、折合流速、折合柱長(zhǎng)。其特點(diǎn)是對(duì)于不同粒度的填料能得到相同的H—ur 曲線，因此可以在相同的條件下比較不同填料的柱效。

　　6、色譜柱A長(zhǎng)度為15cm，載體粒度為5m.另一B柱長(zhǎng)為30cm，載體粒度為10m，兩柱的柱效相等嗎? 解：A柱的折合柱長(zhǎng)為30000，B柱的折合柱長(zhǎng)也為30000，表明組分在兩根柱內(nèi)從柱人口到出口都經(jīng)過(guò)30000個(gè)載體顆粒.兩校的柱效相等。

　　7、何謂梯度淋洗，適用于哪些樣品的分析?與程序升溫有什么不同? 解：梯度淋洗就是在分離過(guò)程中.讓流動(dòng)相的組成、極性、pH值等按‘定程序連續(xù)變化。使樣品中各組分能在最佳的k下出峰。使保留時(shí)間短、擁擠不堪、甚至重疊的組分，保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而峰形扁平的組分獲得很好的分離，特別適合樣品中組分的k值范圍很寬的復(fù)雜樣品的分析。梯度淋洗十分類(lèi)似氣相色譜的程序升溫，兩者的目的相同。不同的是程序升溫是通過(guò)程序改變柱溫。而液相色譜是通過(guò)改變流動(dòng)相組成、極性、pH值來(lái)達(dá)到改變k的目的。

　　8、流動(dòng)相為什么要預(yù)先脫氣?常用的脫氣方法有哪幾種? 解：流動(dòng)相中溶解氣體存在以下幾個(gè)方面的害處，氣泡進(jìn)入檢測(cè)器，引起光吸收成電信號(hào)的變化，基線突然跳動(dòng)，干擾檢測(cè);溶解在溶劑中的氣體進(jìn)入色譜柱時(shí)，可能與流動(dòng)相或固定相發(fā)生化學(xué)反應(yīng);溶解氣體還會(huì)引起某些樣品的氧化降解.對(duì)分離和分析結(jié)果帶來(lái)誤差。因此，使用前必須進(jìn)行脫氣處理。常用的脫氣法有以下幾種：(1)加熱脫氣法;(2)抽吸脫氣法;(3)吹氦脫氣法;(4)超聲波振蕩脫氣法。

　　9、按固定相孔徑大小分類(lèi)，液相色譜固定相有哪幾類(lèi)?各有什么特性及適用范圍? 解：從固定相的孔隙深度考慮，液相色譜固定相分為表面多孔型(薄殼型)和全多孔型(全孔型)兩類(lèi)。

　　表面多孔型固定相多孔層厚度小.孔淺，相對(duì)死體積小，出峰迅速，柱效高，顆粒較大，滲透性好，由于孔淺，梯度淋洗時(shí)，當(dāng)流動(dòng)相成分改變后.孔內(nèi)外流動(dòng)相成分能迅速達(dá)到平衡，機(jī)械強(qiáng)度高，裝柱容易，其不足的是由于多孔層厚度小，因而柱容量小，最大允許樣品量受到限制，適用于比較簡(jiǎn)單的樣品分析及快速分析。

　　全多孔型固定相，由于顆粒很細(xì)，孔仍然很淺.傳質(zhì)速度較快，柱效高。梯度淋洗時(shí)孔內(nèi)外流動(dòng)相成分的平衡速度仍然較快.其最大特點(diǎn)是柱容量大，最大允許樣品量是表面多孔型的5倍，但裝填的什于滲透性低，因而需要更高的操作壓力.制柱比表面多孔型的難。這種固定相特別有利于痕量組分及多組分復(fù)雜混合物的分離分析。

　　10、什么叫化學(xué)鍵合色譜? 與液—液色譜相比有何優(yōu)點(diǎn)? 解：通過(guò)化學(xué)反應(yīng)，將固定液鍵合到載體表面，此種固定相稱(chēng)為化學(xué)鍵合固定相;采用化學(xué)鍵合固定相的色譜法，稱(chēng)為化學(xué)鍵合色譜。

　　與液—液分配色譜相比，鍵合色譜法的主要優(yōu)點(diǎn)：(1)化學(xué)鍵合固定相非常穩(wěn)定，在使用過(guò)程中不流失。(2)適宜用梯度淋洗。(3)適合于k范圍很寬的樣品。(4)由于鍵合到載體表面官能團(tuán)，既可是非極性的，也可是極性的，因此應(yīng)用面廣。

　　11、(選擇題)在液相色譜中，常用作固定相合相基體的物質(zhì)是 A.分子篩 B.硅膠 c氧化鋁 D.活性炭 解：B.硅膠。

　　要形成化學(xué)鍵合固定相，所用的基質(zhì)材料應(yīng)有某種化學(xué)反應(yīng)活性，在四種固體固定相中只有硅膠合有硅醇基，是能進(jìn)行鍵合的活性官能團(tuán)。

　　12、高效液相色譜柱有哪幾種類(lèi)型? 細(xì)徑柱有什么優(yōu)點(diǎn)? 解：高效液相色譜拄大致可分為三種類(lèi)型：內(nèi)徑小于2mm的稱(chēng)為細(xì)管徑或微管徑柱;內(nèi)徑在2~5mm范圍內(nèi)的是常規(guī)高效液相色譜柱;內(nèi)徑大于5mm的一般稱(chēng)為半制備柱或制備柱。細(xì)管徑柱的主要優(yōu)點(diǎn)是：(1)分離效能高。(2)流動(dòng)相最佳流速低，消耗量少。(3)可采用多種檢測(cè)器，便于聯(lián)用(CLC MS，CLC-FTIR)。(4)采用細(xì)而短的毛細(xì)管柱可以提高分析速度，實(shí)現(xiàn)快速分析。

　　13、什么叫反相色譜?試從固定相、流動(dòng)相、流出次序、流動(dòng)相極性的影響等幾個(gè)方面比較正相和反相的區(qū)別。

　　解：流動(dòng)相的極性比固定相的極性強(qiáng)的色譜體系叫反相色譜。例如以十八烷基硅膠鍵合相(ODS)為固定相，以甲酵/水作流動(dòng)相，是典型的反相色譜。正相色譜和反相色譜這兩種操作模式的主要區(qū)別見(jiàn)下表： 正相和反相色譜的區(qū)別 比較項(xiàng)目正相色譜反相色譜 固定相 流動(dòng)相 流出次序 流動(dòng)相極性的影響極性 非(弱)極性 極性組分k大 極性增加，k減小非(弱)極性 極性 極性組分k小 極性增加，k增大 14、對(duì)液相色譜流動(dòng)相有何要求? 解：用作液相色譜流動(dòng)相的溶劑，其純度和化學(xué)特性必須滿足色譜過(guò)程中穩(wěn)定性和重復(fù)性的要求。對(duì)樣品要有一定的溶解能力，粘度小，化學(xué)穩(wěn)定性好，避免發(fā)生不可逆的化學(xué)吸附。溶劑應(yīng)與檢測(cè)器相匹配，不干涉所使用檢測(cè)器的工作，制備色譜的溶劑應(yīng)不干擾對(duì)分離各組分的回收。除此以外，選擇的溶劑對(duì)所給定的樣品組分具有合適的極性和良好的選擇性。

　　15、在150×2mm硅膠柱流動(dòng)相為已烷/甲醇(150：2)，紫外檢測(cè)器色譜條件下分離丙烯酰胺，判斷以下組分的出峰次序，為什么? 解：在給定的色譜條件下，組分B先出峰，組分A后出峰。以硅膠為固定相，己烷/甲醇(150：2)為流動(dòng)相，該體系為正相色譜，樣品的極性A>B，在正相色譜體系極性小的組分先出峰，極性大的組分后出峰，所以出峰次序?yàn)锽先出，A后出。

　　16、在硅膠往上，用甲苯為流動(dòng)相，某組分的保留時(shí)間為30min，如果改用四氯化碳或乙醚為流動(dòng)相，試指出選用哪一種溶劑能減少該組分的保留時(shí)間? 為什么? 解：該體系為正向色譜體系。在該體系中流動(dòng)相的極性增大保留值減小。流動(dòng)相甲苯、四氯化碳及乙醚的溶劑強(qiáng)度參數(shù)分別是0.29、0.18、0.38，因此選用溶劑強(qiáng)度參數(shù)大于甲苯的乙醚，可縮短該化合物的保留時(shí)間。

　　17、在高效液相色譜中，組分和溶劑分子之間存在哪幾種作用力? 解：存在色散力、偶極作用、氫鍵作用和介電作用等四種作用力。

　　18、什么是溶劑極性參數(shù)與溶劑強(qiáng)度? 它們之間的關(guān)系如何? 解：溶劑分子與溶質(zhì)分子以色散力、偶極作用力、氫鍵作用力及介電作用力四種方式進(jìn)行相互作用的能力稱(chēng)為分子的“極性”，溶劑的這種能力以溶劑極性參數(shù)P’表示，P’值越大，溶劑的極性越強(qiáng)。

　　溶劑強(qiáng)度指用作流動(dòng)相的溶劑，將組分從色譜柱上洗脫下來(lái)的能力。

　　溶劑強(qiáng)度直接與溶劑的極性有關(guān)，而且隨不同色譜體系而變，在正相色譜體系中，溶劑極性增加，使組分從柱上洗脫下來(lái)的能力增加，即P’越大的溶劑，溶劑強(qiáng)度越大。在反相色譜中，溶劑極性減小，使組分從柱上洗脫下來(lái)的能力增加，即P’越小的溶劑，溶劑強(qiáng)度越大。

　　19、預(yù)測(cè)在正相色譜與反相色譜體系中，組分的出峰次序。

　　解：在正相色譜體系中組分的出峰次序?yàn)椋簶O性弱的組分，在流動(dòng)相中溶解度較大，因此k值小，先出峰。極性強(qiáng)的組分，在固定相中的溶解度較大，因此k值大，后出峰。

　　在反相色譜中組分的出峰次序?yàn)椋簶O性弱的組分在固定相上的溶解度大，k值大，后出峰，相反極性強(qiáng)的組分在流動(dòng)相中溶解度大，k值小，所以先出峰。

　　20、在ODS固定相上，以甲醇為流動(dòng)相，某組分的分配容量k1=1.2，如以乙腈為流動(dòng)相，其k增加還是減少? 為什么? 解：據(jù)題意為反相色譜體系。

　　k值增加，在反相色譜體系中，流動(dòng)相由甲醇變?yōu)橐译，溶劑極性參數(shù)由5.1變?yōu)?.8，增加了，但組分在流動(dòng)相中的溶解度反而減小，所以k值增大。由1.2增大為2.24。

　　21、在反相色譜中，流動(dòng)相從40%(V/V)甲醇—水改變?yōu)?0%(V/V)甲醇—水，問(wèn)組分的調(diào)整保留值將改變多少? 為什么? (P’ 甲醇=5.1，P’ 水=5.1)

　　提示：對(duì)于由溶劑A和B組成的二元混合溶劑，其極性可表示為 Pab ‘=a P a’ b P b’ 式中a和b分別為溶劑A和B在混合溶劑中的分?jǐn)?shù)。

　　解：在40%配比時(shí)，混合溶劑的極性為 P1’ =0.46×5.1 0.6×10.2=8.16 在60%配比時(shí)，混合溶劑的極性為 P2’ =0.6×5.1 0.4×10.2=7.14 P2’= P2’- P2’=7.14-8.16= -1.02 根據(jù)反相色譜體系 ∴在反相色譜中，流動(dòng)相的極性變?nèi)?P’由8.16變?yōu)?.14)，溶劑強(qiáng)度增加，洗脫能力增加，因而使組分的調(diào)整保留時(shí)間減少到原來(lái)的1/3.2。

　　22、某色譜體系采用25%三氯甲烷/正己烷為流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)組分分離不十分理想，想通過(guò)改變流動(dòng)相的選擇性來(lái)改善分離選擇性，選用乙醚/正己烷為流動(dòng)相，問(wèn)乙醚/正己烷的比例為多少? (P’ CHCl3=5.1，P’乙醚=5.1)

　　提示：流動(dòng)相選擇性的改變是通過(guò)保持溶劑強(qiáng)度不變時(shí)改變流動(dòng)相組成來(lái)實(shí)現(xiàn)的，改變前流動(dòng)相A/B和改變后的流動(dòng)相A/C的組成有下列關(guān)系： 解：25%的CHCl3/正己烷與37%乙醚/正己烷的溶劑強(qiáng)度相等，但對(duì)樣品的分離選鋒性不同。

　　23、什么叫離子色譜? 解：在低交換容量的分離柱上，分離樣品離子，而在高交換容量的抑制柱上，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)，把具有高電導(dǎo)的流動(dòng)相轉(zhuǎn)變?yōu)榈碗妼?dǎo)的流動(dòng)相，這樣就可以在電導(dǎo)檢測(cè)器上對(duì)被分離樣品離子進(jìn)行高靈敏度的檢測(cè)。這種采用分離柱、抑制柱和電導(dǎo)檢測(cè)器相結(jié)合的離子交換色譜稱(chēng)為離子色譜。

　　24、為什么凝膠色譜中任何組分的分配系數(shù)必須符合0≤K≤1?如果K>l說(shuō)明什么問(wèn)題? 解：因?yàn)榻M分的分配系數(shù)為K=Cs/Cm ，C s與Cm分別為組分在固定相和流動(dòng)相中的濃度，當(dāng)分子直徑大于固定相孔徑時(shí)，此時(shí)Cm=0，∴K=0。當(dāng)分子直徑小于孔徑時(shí)，組分向孔隙內(nèi)流動(dòng)相擴(kuò)散，達(dá)到平衡時(shí)，一半組分在孔隙內(nèi)，一半在孔隙外，此時(shí)K=1.0，若分子直徑介于以上兩種極限情況之間，K一定介于0與1之間.可見(jiàn)在凝膠色譜中，任何組分的分配系數(shù)為0≤K≤1，如果K>1，這說(shuō)明此時(shí)的分離方式已不是純粹的凝膠色譜，其分離過(guò)程受到其他作用力(如吸附)的支配。

　　25、某人用凝膠色譜分離一高聚物樣品，分離情況很差，他改變流動(dòng)相的組成后，分離情況大為改進(jìn)，這種說(shuō)法對(duì)嗎? 為什么? 解：這種說(shuō)法不對(duì)。在凝膠色譜中流動(dòng)相只起運(yùn)載的作用，不能依靠改變流動(dòng)相的性質(zhì)和組成來(lái)改善色譜體系的選擇性。凝膠色譜的選擇性只能通過(guò)選擇合適的固定相，根據(jù)固定相孔隙的大小以及孔徑分布范圍的最佳化來(lái)實(shí)現(xiàn)。題目中“改變流動(dòng)相組成后，分離情況大為改進(jìn)”是不可能的。

　　26、(選擇題)液相色譜中通用型檢測(cè)器是 A.紫外吸收檢測(cè)器 B.示差折光檢測(cè)器 C熱導(dǎo)池檢測(cè)器 D.熒光檢測(cè)器 解：B.示差折光檢測(cè)器。

　　A、D為選擇性檢測(cè)器，C為氣相色譜中通用檢測(cè)器。

　　27、為了測(cè)定鄰氨基苯酚中微量雜質(zhì)苯氨，現(xiàn)有下列固定相：硅膠、ODS鍵合相，下列流動(dòng)相：水—甲醇、異丙醚—己烷，應(yīng)選用哪種固定相、流動(dòng)相? 為什么? 解：鄰氨基苯酚中微量雜質(zhì)苯氨測(cè)定，為了良好分離，應(yīng)讓苯氨先出峰，由于苯氨的極性小于鄰氨基苯酚，因此應(yīng)采用正相色譜法，應(yīng)選硅膠為固定相，異丙醚—己烷為流動(dòng)相。

　　28、在ODS鍵合固定相，甲醇—水為流動(dòng)相時(shí)試判斷四種苯并二氮雜苯的出峰順序。為什么? 解：色譜條件為反相鍵合色譜體系，在反相色譜體系中極性大的組分k小，首先出峰，按四種苯并二氮雜苯的結(jié)構(gòu)，出蜂順序?yàn)?—3—2—1。

　　29、用多孔凝膠為固定相，流動(dòng)相為四氫呋喃，分離以下各組分，試判斷各組分的出蜂順序。為什么? 解：凝膠色譜組分的出峰次序是根據(jù)分子尺寸大小，大的先出峰.故出峰次數(shù)為n=9、8、7。

　　30、分離含胺類(lèi)和季銨接的樣品，以0.2M HClO4溶液為固定相，以丁醇—二氯甲烷—己烷為流動(dòng)相，已知組分A的保留時(shí)間為8.2min，死時(shí)間為1.0min.在另一根柱上.其他條件均不改變，只將HClO4的濃度增加一倍，間組分A在第二根柱上的移動(dòng)速率，是在第一根柱上的幾倍? 解：從題意分析知，該題分離類(lèi)型是正相離子對(duì)色譜，因此K與KBP的關(guān)系為： A在第二根柱上的移動(dòng)速率是第一根柱的1.78倍。