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液相色譜手性制備分離過程中的問題探討

[2013/1/18]

　　本文擬通過一些具體實例來介紹多糖類手性固定相在高效液相色譜法分離對映異構體中的應用。對多糖類手性固定相類型、手性識別機理、影響手性拆分能力的因素以及制備分離過程中的樣品溶解度問題等做了較為詳實的闡述與討論。

　　現(xiàn)實需求：手性藥物的不同對映體往往顯示出不同的藥理學、毒理學及藥代動力學性質，出于用藥安全性考慮，藥品監(jiān)管部門要求對潛在手性藥物的各自對映體必需進行分離和活性(毒性)測試。因此，單一構型手性化合物的獲得對于藥理和毒理實驗的開展是極其重要的。一般可以通過手性合成和手性拆分兩種途徑來獲取單一異構體。各種手性拆分技術中，色譜法因其快速、高效、經濟等優(yōu)勢而得到廣泛應用。(手性合成方面，請參考相關專著。)

　　案例分析：mg-50g級的單一構型手性化合物各自純品(即兩種構型都需要)。其中之一很可能就是安全有效的候選藥物。為了盡快獲得各異構體以盡早開展藥理、毒理試驗，藥物發(fā)現(xiàn)階段，許多制藥公司都暫緩在不對稱合成上的投入，而是敏銳快捷地轉向手性色譜分離，迅速地從不太貴的消旋體混合物中分離出高純度的對映體。手性藥物早期開發(fā)階段，不差錢!這時候最要緊的是時間和對映體純度。時間就是金錢，早期占得先機，后來財源滾滾!

　　解決方案：藥物發(fā)現(xiàn)階段，由于手性化合物需求量少(mg-50g級，相對于后期公斤級全面開發(fā)及噸位級生產來講，小巫見大巫。。。)，為盡快盡早獲得單一光學純物質，采用手性色譜制備分離策略。

　　具體方法：擬采用多糖類手性固定相高效液相色譜法(PreparativeChiralHPLC)

　　方法步驟：手性HPLC制備分離對映體，對于某一個具體樣品，如何開始chiralHPLC方法建立?對映體在手頭上已有商品柱上能否直接分離，是否可以放大等?

　　對于液相色譜法手性制備拆分對映體，其步驟大致如下：1)、了解待分離化合物樣品結構信息;2)、選擇合適的手性固定相(手性分析柱);3)、對所選的分析柱進行篩選，優(yōu)化色譜條件;4)將分析條件轉移到制備柱上，并對放大分離條件做最后的調整(analyticalchiralHPLC→preparativechiralHPLC);5)、開始制備拆分，若條件允許的話，可以自動進樣;6)去除溶劑，回收產品。具體操作起來，可以這么考慮：

　　1)、了解待分離化合物樣品結構信息：手性方法建立的第一步為檢查待測物的化學結構，盡可能地獲取樣品的如下信息——在不同溶劑中的溶解度(由于是制備分離，我們期望盡量多的樣品溶于相對小的溶劑中。除了分離選擇性，樣品溶解度通常是建立PreparativeChiralHPLC方法的主要障礙。許多情況下，樣品因在流動相中沒有足夠大的溶解度，因而影響單針上樣量，更甚至于沉積于制備柱上而無法洗脫。);形成氫鍵H-、π鍵或者偶極相互作用的能力;是否有極性官能團(是否含氨基NH2-、羧基-COOH或者既含酸性基團又有堿性基團);手性中心附近有無大取代基;紫外光譜可否檢測等。諸如此類的樣品結構信息對預判手性分離能力及手性固定相的選擇有較大的幫助作用。

　　2)、怎樣選擇合適的手性柱：由于手性方法是用于制備分離，在選擇手性柱時就應考慮柱容量(柱樣品荷載量)。從手性固定相通用性考慮，各商品化的手性柱通用性大致順序為：多糖柱﹥蛋白柱﹥糖肽柱﹥配體交換柱。

　　多糖類手性固定相基于其獨特的分子結構特征在手性分離方面顯示出卓越的性能，已經廣泛用于各種各樣手性分子對映體的分析和制備分離。所以，選定多糖柱作為制備分離用手性柱。

　　3)、手性色譜條件優(yōu)化：手性液相色譜法，與普通液相色譜類似，方法建立時主要包括手性柱的篩選和流動相條件的優(yōu)化兩個方面。

　　手性柱篩選方面，即便是在選定多糖類手性柱的情況下，由于有多種柱型可供選擇，以致于難于確定最好以哪一種柱子開始實驗。據(jù)已報導的大部分應用研究，Daicel公司“四大金剛”淀粉類ChiralpakAD-H、ChiralpakAS-H和纖維素類Chiralcel-OD-H、ChiralpakOJ-H聯(lián)合使用可成功分離80%未知樣品。但依據(jù)個人經驗，最英明神武的決策是重用“兩大護法”-ChiralpakAD-H和Chiralcel-OD-H(或者新型共價鍵合手性柱ChiralpakIA和ChiralpakIC)，這兩者在多糖類手性柱中應用最為廣泛，可用于多種結構類型樣品的分離。直鏈淀粉的螺旋結構和纖維素的線性結構，在對映體拆分方面具有手性分離互補特征，ChiralpakAD-H和Chiralcel-OD-H(或者ChiralpakIA和ChiralpakIC)配合使用，優(yōu)勢互補，珠聯(lián)璧合，大大的好。。。

　　流動相條件的優(yōu)化方面，多糖類手性柱大多在正相模式下分離。方法建立初始階段，首先嘗試在ChiralpakAD-H柱(或ChiralpakIA柱)上，以無水乙醇/正己烷為流動相，通過調整流動相中醇的含量或者改變醇的種類來增強對映體分離選擇性。如果只有部分分離或者仍沒有分離，可在流動相中添加有機酸、堿等改性劑來優(yōu)化分離。同時，可以考察柱溫對分離的影響。如果發(fā)現(xiàn)分離還不理想，再使用另一殺手锏，換用Chiralcel-OD-H(或ChiralpakIC)柱，重復考察前面的各影響因素。若背，喝涼水都塞牙——使用多糖類手性柱未能獲得滿意的分離度，則另做打算嘗試其他類型的手性柱。

　　手性色譜條件優(yōu)化流程總結如下：

　　4)、分析方法轉移：一旦合適的分析條件被確定下來，手性制備分離的第一步旗開得勝，接下來的工作進展就相當?shù)仨樌。一般來說，用于制備分離的填料粒徑(20um)要大于以分析為目的的手性固定相粒徑(5um)，同時色譜柱的尺寸也有所不同。分析條件轉換到半制備、制備規(guī)模上來，主要是流速和進樣量的調整。制備之前，最好先作“理論分析”(或者憑以往實戰(zhàn)經驗預判)，接著做小批量的實驗逐步證實，放大分離。

　　5)、制備分離：制備手性液相色譜(PreparativeChiralHPLC)，除了在分析型AnalyticalHPLC上摸索分離條件之外，一般來講，樣品的溶解度非常重要。若樣品在流動相中沒有足夠大的溶解度，這使得樣品濃度不高因而嚴重制約單針上樣量。多糖類手性柱大多在正相模式下分離，使用醇/正己烷作為流動相體系，等度洗脫。實際應用中，越擔心什么偏偏就發(fā)生什么，經常會糾結于正相分離模式下樣品溶解度不夠大的問題。針對樣品溶解度問題，具體問題具體分析，特殊情況特殊關照，想方設法提高樣品的溶解度。

　　提高樣品溶解度的策略：總體原則是——千方百計，想方設法增大樣品溶解度，但不改變溶劑洗脫強度或者影響分離選擇性。

　　策略一：從樣品化合物結構自身入手，通過結構修飾，引入保護基做成衍生物來增強其在有機溶劑中的溶解度。原則是通過衍生物使溶解性變好，且不影響對映體分離選擇性或者提高其選擇性，同時保護基容易引入和脫除。比如某些類型的手性胺(伯胺和仲胺)，加上一個Boc或者Cbz保護基，溶解性會戲劇性地變好，方便很好地進行分離。

　　策略二：若流動相不能溶解足夠量樣品，則可以探索不同于流動相的樣品溶劑。比如，先用能溶解更多樣品的單一溶劑(諸如異丙醇或者無水乙醇)溶解待分離物，然后用流動相稀釋，以不析出為度;或者根據(jù)樣品化合物結構，通過調節(jié)pH值或者樣品溶劑離子強度的變化來增加樣品溶解度，比如溶解樣品時，往溶劑中添加一定體積的有機酸(冰乙酸、三氟乙酸)、有機堿(二乙胺、三乙胺)、離子對試劑(甲基磺酸、乙基磺酸)等來助溶，但前提是以不影響化合物的穩(wěn)定性和對映體色譜分離選擇性為準。樣品溶劑對色譜分離的影響，可在分析型chiralHPLC上考察，然后轉移到制備上。

　　策略三：巧用重迭進樣(stackinjection)。我們知道，在RP-HPLC梯度洗脫條件下，進樣后，待測物必須完全流出色譜柱后才能進下一針，即進樣是間歇式的。但正相模式下的手性分離，等度洗脫，根據(jù)樣品化合物出峰時間，可以有針對性地選擇間歇式的單針進樣還是重迭進樣(即上一針還未洗脫下來，掐算好出峰時間，把握時機進下一針)。重迭進樣(stackinjection)省時增效、節(jié)能減排，綠色環(huán)保，符合建設資源節(jié)約型、環(huán)境友好型社會的時代要求。比如某手性制備拆分，若單針進樣的話，需要運行32min，兩異構體在16.5-30min時間段出峰，前16min時間柱上分離近似于在走基線，同時留意到兩個色譜峰16min內能完全流出色譜柱。類似這種情況下，我們就可以考慮使用重迭進樣的策略來縮短分離時間，節(jié)省溶劑消耗，降低廢液排放。

　　6)、回收產品：去除溶劑，這一點與反相制備色譜類同，但手性制備分離是在正相模式等度洗脫條件下進行的，溶劑回收后可以循環(huán)再利用，繼續(xù)用于該分離項目。在實際工作中踐行循環(huán)經濟發(fā)展理念，建設生態(tài)文明社會。如何確定所得兩個異構體的立體構型，R-、S-型洗脫順序怎樣呢?這點可在除去溶劑后，旋光儀測定偏振光方向，正( )還是負(-)，與文獻報導值比對，即可確定R-、S-構型。條件優(yōu)越的話，可使用在線旋光檢測器或者圓二色檢測器跟蹤對映體的洗脫順序。

　　歸納總結：手性色譜法是最重要的手性分離技術之一，不僅可以快速地測定對映體純度(對映體過量值)，而且也可以用于制備拆分光學異構體。在眾多已商品化的手性固定相中，多糖類手性固定相因分離選擇性好、柱容量大而被廣泛使用。本文探討了多糖類手性固定相在制備分離中的應用，快速篩選手性固定相(手性柱)和優(yōu)化流動相條件(醇等調節(jié)劑和改性劑)是成功的關鍵。同時，樣品溶解度是影響拆分速度的一個重要因素？梢耘c其它較便宜的純化方法(重結晶、化學拆分法)相結合以降低操作的總體成本。