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生物樣本冷凍儲(chǔ)存技術(shù)

[2013/1/19]

　　1 儲(chǔ)存溫度

　　生物樣本的長(zhǎng)期儲(chǔ)存通常使用盡可能低的溫度來(lái)降低樣本內(nèi)的生化反應(yīng)提高樣本內(nèi)各種成分的穩(wěn)定性。生物大分子、細(xì)胞、組織和器官的常用儲(chǔ)存溫度有-800C(超低溫冰箱), -1400C(液氮?dú)庀嗷蛏罾浔?以及-1960C(液氮液相)，溫度越低樣本的穩(wěn)定保存時(shí)間越長(zhǎng)。0～-600C是水的結(jié)晶溫度，容易對(duì)細(xì)胞和組織的微觀結(jié)構(gòu)造成傷害，一般不使用這一溫度來(lái)保存組織和細(xì)胞。部分經(jīng)過(guò)提純的生物大分子可以在0～-600C穩(wěn)定保存一定時(shí)間，但在組織樣本內(nèi)生物大分子受到細(xì)胞組織內(nèi)多種因素的影響，穩(wěn)定性有可能明顯降低，所以通常樣本庫(kù)不使用0～-600C作為儲(chǔ)存溫度。

　　-800C樣本儲(chǔ)存

　　-800C低于危害性較大的水的結(jié)晶溫度范圍，也是常用設(shè)備超低溫冰箱能達(dá)到的溫度，基于操作簡(jiǎn)便性、儲(chǔ)存量和成本等因素來(lái)考量，這一溫度也是目前保存樣本中生物大分子活性的常用溫度。但對(duì)不同的生物大分子活性這一溫度下能保持多久仍無(wú)定論。組織中DNA的穩(wěn)定性可以在-800C下可以保持?jǐn)?shù)年或更長(zhǎng)時(shí)間。但對(duì)RNA來(lái)說(shuō)，則容易被廣泛分布于細(xì)胞和各種組織里的RNA酶逐漸降解，在不同的細(xì)胞和組織中，RNA穩(wěn)定儲(chǔ)存的時(shí)間長(zhǎng)短也有較大的區(qū)別，但一般不超過(guò)5年，在一些敏感實(shí)驗(yàn)內(nèi)，RNA在-800C下不到一年就發(fā)生了測(cè)得出的降解，所以為長(zhǎng)期保存RNA活性，建議使用更低的溫度，或者利用小部分樣本提取RNA與剩余樣本同步儲(chǔ)存。其他樣本內(nèi)的蛋白質(zhì)和脂類等生物大分子在樣本內(nèi)在-800C下也能保存，但時(shí)間長(zhǎng)短不一，穩(wěn)定性逐漸衰減。如果為保護(hù)樣本里已知的特定生物大分子，也可加入該分子的穩(wěn)定劑。如果樣本里要保存的生物大分子未定，建議使用更低的溫度儲(chǔ)存。另外目前常見(jiàn)的大型自動(dòng)化樣本存取設(shè)備只能和-800C超低溫設(shè)備配套使用，尚不能夠和液氮設(shè)備配套使用。英國(guó)的UK Biobank則是把一部分樣本的拷貝(～950萬(wàn))儲(chǔ)存在-800C做工作樣本，使用自動(dòng)化設(shè)備存;另一部分拷貝(～550萬(wàn))在另外一個(gè)地方儲(chǔ)存在液氮?dú)庀嘀凶霭踩珎浞荩瑯颖臼謩?dòng)存取。

　　-1400C樣本儲(chǔ)存

　　-1400C是低于水的玻璃化溫度(～-1360C)，也是液氮?dú)庀嗪蜕罾浔淠軌蜻_(dá)到的溫度，樣本在這一溫度范圍內(nèi)其生物學(xué)活動(dòng)極大降低，是保存樣本中細(xì)胞活性的理想溫度。和冰水混合物能維持在00C的相變溫度類似，絕緣的液氮容器內(nèi)液相和氣相氮應(yīng)該維持在相變溫度-1960C。但實(shí)際上由于液氮容器蓋子不夠密封，從而導(dǎo)致在液氮液面和液氮容器罐口之間形成一個(gè)溫度梯度。美國(guó)國(guó)家癌癥研究所建議液氮容器口處的溫度應(yīng)保持在-1400C以下，未來(lái)用途未確定的樣本應(yīng)以液氮?dú)庀嗄Ｊ絻?chǔ)存，以保護(hù)組織內(nèi)細(xì)胞活性。

　　深冷冰箱是電制冷，無(wú)需液氮，裝滿樣品后的穩(wěn)定溫度通常在-140以下，和使用液氮?dú)庀嘞啾龋鋬?yōu)勢(shì)在于不需頻繁添加液氮，維護(hù)方便。但電制冷的降溫速度低于液氮，一旦開(kāi)啟容器取放樣品時(shí)容易造成較大范圍的溫度波動(dòng)，溫度恢復(fù)時(shí)間也相對(duì)較長(zhǎng)，因而更適合較少開(kāi)啟取放樣品的情況。另外電制冷冰箱必須保障供電。在斷電情況下推薦使用液氮設(shè)備以提供備份儲(chǔ)存。

　　-1960C樣本儲(chǔ)存

　　-1960C是液氮揮發(fā)的溫度，因而只有液氮液相保存技術(shù)能達(dá)到此溫度。樣本內(nèi)的生命活動(dòng)在此溫度下基本停止，樣本的穩(wěn)定性可以得到長(zhǎng)期的保存。是長(zhǎng)期保存樣本內(nèi)細(xì)胞活性、組織器官的復(fù)雜結(jié)構(gòu)及活性的最有效方法，得到廣泛認(rèn)可。與其它不同溫度冷凍模式相比，液氮容器液相儲(chǔ)存樣品需要進(jìn)一步防護(hù)樣品間交叉污染。美國(guó)國(guó)家癌癥研究所推薦使用帶螺旋的凍存管封裝樣本。但在降溫過(guò)程中樣品從超低溫冰箱(-800C)轉(zhuǎn)移到液氮中時(shí)驟然降溫，引起凍存管帽和管身收縮不一致，容易導(dǎo)致液氮滲入凍存管從而增加了樣品間交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)。解決的辦法之一是可以使用專門的凍存管套對(duì)每個(gè)凍存管進(jìn)行熱縮密封，或是使用密封膜在凍存管帽與管身接口處纏2-3圈再儲(chǔ)存。前一種方法會(huì)使管身加長(zhǎng)而需要較高的凍存盒，第二種辦法會(huì)使管身略變粗，推薦使用底部間隔的10x10規(guī)格的常規(guī)凍存盒。

　　2 冷凍技術(shù)

　　上世紀(jì)50-70年代Basil Luyet，James Lovelock，Peter Mazur等學(xué)者針對(duì)冷凍對(duì)細(xì)胞和組織的影響展開(kāi)深入研究，發(fā)現(xiàn)損傷主要來(lái)源于冰晶損傷和溶液滲透壓損傷。隨著溫度的下降，細(xì)胞內(nèi)外的水分結(jié)冰，所形成的冰晶會(huì)造成細(xì)胞膜和細(xì)胞壁破壞，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。這種因細(xì)胞內(nèi)部結(jié)冰而引起的細(xì)胞損傷即冰晶損傷(Intracellular ice damage)。冰晶損傷是由冷卻速度過(guò)快造成，冷卻速度越快，冰晶損傷越大。同時(shí)隨著溫度的下降，細(xì)胞外部的水分會(huì)先結(jié)冰，從而使得未結(jié)冰的溶液中電解質(zhì)濃度升高，細(xì)胞膜上的脂質(zhì)會(huì)因長(zhǎng)時(shí)問(wèn)暴露在高溶質(zhì)的溶液中而受到損壞，細(xì)胞發(fā)生脫水滲漏，導(dǎo)致在復(fù)溫時(shí)大量水分滲入細(xì)胞內(nèi)造成細(xì)胞死亡。這種因保存溶液溶質(zhì)濃度增高而形成的細(xì)胞損傷被稱為溶液損傷(Solution damage)。溶液損傷是由冷卻速度過(guò)慢，使細(xì)胞在高濃度的溶液中暴露的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而造成，冷卻速度越慢，此損傷越嚴(yán)重。

　　程序降溫/分步降溫(programmed freezing/stepwise freezing)

　　通過(guò)控制樣本的降溫速度可以盡量減少冰晶損傷和溶液損傷。降溫速度的控制可通過(guò)在不同的溫度下分階段降溫(stepwise freezing)或者程序控制降溫(programmed freezing)實(shí)現(xiàn)。與分步降溫相比，程序降溫儀通過(guò)時(shí)時(shí)調(diào)節(jié)往凍存空間噴放液氮的流量能更精準(zhǔn)地控制樣本本身的降溫速度。比如在0—-50C液體樣本轉(zhuǎn)變?yōu)楣腆w發(fā)生相變時(shí)會(huì)產(chǎn)生熱量，引起樣本的回溫，造成樣本額外傷害。程序降溫儀能夠在相變時(shí)加大降溫力度避免這一傷害。程序降溫儀在凍存精子、卵子、受精卵、干細(xì)胞、皮膚等樣本中得到了廣泛的應(yīng)用，全球大約有30-40萬(wàn)體外受精的嬰兒使用了這一方法。一個(gè)凍存程序通常包括慢凍、快凍等幾個(gè)階段，在凍存保護(hù)劑存在的情況下常見(jiàn)的凍存速度慢凍0.3-1.50C/分鐘,快凍5-80C/分鐘。在0～-400C的區(qū)間不少程序使用的是慢凍。但具體的降溫程序隨凍存樣本的不同可能有較大的差別。

　　玻璃化冷凍(Vitrification)

　　玻璃化冷凍的理論首先由Luyet提出。液體的凝固可分為兩種形式：一種是晶體化，溶液中的分子呈有序排列;另一種情況是非晶體即玻璃化，液體中的分子呈無(wú)序狀態(tài)，保持未凝固前的狀態(tài)。 正常冷凍時(shí)水容易在細(xì)胞內(nèi)形成晶體造成晶體損傷，在細(xì)胞外形成晶體造成溶液損傷。但在超快速玻璃化冷凍的條件下細(xì)胞內(nèi)外均呈玻璃化凝固，無(wú)冰晶形成或僅形成很小的冰晶，不致對(duì)細(xì)胞膜和細(xì)胞器不致造成損傷，細(xì)胞也不會(huì)在高濃度的溶質(zhì)中長(zhǎng)時(shí)間暴露而受損。但玻璃化冷凍所需要的超的高速降溫很難在常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件下實(shí)現(xiàn)。1981年Fahy提出用高濃度的冷凍保護(hù)液(玻璃化溶液)的方法大大降低了對(duì)降溫速度的要求，并與1985年由Rail和Fahy完成鼠胚的玻璃化凍存，實(shí)現(xiàn)這一技術(shù)的使用突破。

　　玻璃化冷凍是一種較新的技術(shù)，適合用于一些常規(guī)程序降溫難以處理的樣本，比如復(fù)雜的組織和器官。但對(duì)于常規(guī)程序降溫能夠較好處理的樣本(如細(xì)胞和體積很小的組織)，這一技術(shù)還沒(méi)有展現(xiàn)出特別的優(yōu)勢(shì)。正常的水的玻璃化冷凍需要極快的速度，是常規(guī)實(shí)驗(yàn)室難以實(shí)現(xiàn)的。為了降低組織的玻璃化降溫要求，需要在樣品中加入高濃度的冷凍保護(hù)劑，常用的濃度約在40%～60%(W/V)。即使是幾分鐘的時(shí)間也會(huì)對(duì)細(xì)胞和組織會(huì)帶來(lái)明顯的傷害。所以雖然玻璃化冷凍減少了冷凍過(guò)程的冰晶傷害和溶液傷害，但在一些對(duì)比試驗(yàn)并沒(méi)有表現(xiàn)出更好的效果，反倒是其復(fù)雜的操作帶來(lái)了不便。目前在玻璃化冷凍中，降低冷凍保護(hù)劑損傷的方法主要是使用不同冷凍保護(hù)劑的混合物和阻冰劑(ice blockers)。通過(guò)這一改進(jìn)，Twenty-First Century Medicine成功將冷凍并化凍的兔腎移植到兔子體內(nèi)并保持了正常功能。

　　急凍(Snap freezing)

　　急凍法通常用于保護(hù)純化的生物大分子，或者為了將來(lái)提取生物大分子的組織樣本。做法是將樣本直接放入液氮中，短時(shí)間處理之后轉(zhuǎn)移至超低溫冰箱或更低的溫度環(huán)境儲(chǔ)存。比較常見(jiàn)的例子是冷凍用于將來(lái)提取核酸的組織。這種做法會(huì)損傷大部分細(xì)胞和精細(xì)組織結(jié)構(gòu)，不能用于保存樣本內(nèi)細(xì)胞和組織的活性。

　　3 冷凍保護(hù)劑

　　冷凍保護(hù)劑是指可以保護(hù)細(xì)胞和組織微觀結(jié)構(gòu)免受冷凍損傷的物質(zhì)，通常配成一定濃度的溶液。細(xì)胞懸液中加入冷凍保護(hù)劑可保護(hù)細(xì)胞免受溶液損傷和冰晶損傷。冷凍保護(hù)劑同溶液中的水分子結(jié)合，發(fā)生水合作用，弱化水的結(jié)晶過(guò)程使溶液的粘性增加從而減少冰晶的形成.同時(shí)冷凍保護(hù)劑可以通過(guò)在細(xì)胞內(nèi)外維持一定的摩爾濃度，降低細(xì)胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，使細(xì)胞免受溶質(zhì)的損傷。通常只有紅細(xì)胞、大多數(shù)微生物和極少數(shù)有核的哺乳動(dòng)物細(xì)胞懸浮在不加冷凍保護(hù)劑的水或簡(jiǎn)單的鹽溶液中，并以最適的冷凍速率冷凍，可以獲得活的凍存物。但對(duì)于大多數(shù)有核哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)說(shuō)，在不加冷凍保護(hù)劑的情況下，無(wú)最適冷凍速率可言，也不能獲得活的冷凍物。例如將小鼠骨髓細(xì)胞懸浮在不加冷凍保護(hù)劑的平衡鹽溶液中，并以0.3～6000C/min的冷凍速率降溫冷凍，98%以上的細(xì)胞會(huì)死亡;而加入甘油冷凍保護(hù)劑進(jìn)行冷凍保存時(shí)，98%以上的細(xì)胞都可存活。

　　冷凍保護(hù)劑根據(jù)其是否穿透細(xì)胞膜可分為滲透性和非滲透性兩類。滲透性冷凍保護(hù)劑多是一些小分子物質(zhì)，可以透過(guò)細(xì)胞膜滲透到細(xì)胞內(nèi)。該類保護(hù)劑主要包括二甲基亞砜(Dimethyl Sulfoxide，DMSO)、甘油、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。其保護(hù)機(jī)制是在細(xì)胞冷凍懸液完全凝固之前，滲透到細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生一定的摩爾濃度，降低細(xì)胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，從而保護(hù)細(xì)胞免受高濃度電解質(zhì)的損傷同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)水分也不會(huì)過(guò)分外滲，避免了細(xì)胞過(guò)分脫水皺縮。目前使用較多的是DMSO、甘油、乙二醇和丙二醇等。DMSO對(duì)細(xì)胞的滲透較快，凍存過(guò)程中保護(hù)效果較好，使用比較普遍，常用濃度是5%-10%。但DMSO本身對(duì)細(xì)胞有明顯的傷害，在40C的溫度下傷害尤甚，因此不建議樣本添加DMSO后在此溫度下長(zhǎng)時(shí)間放置，通常與程序降溫儀或梯度降溫盒配合使用實(shí)現(xiàn)溫度連續(xù)勻速降低。

　　非滲透性冷凍保護(hù)劑不能滲透到細(xì)胞內(nèi)，一般是些大分子物質(zhì)，主要包括聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羥乙基淀粉等。其保護(hù)機(jī)制的假說(shuō)很多，其中有一種可能是，聚乙烯吡咯烷酮等大分子物質(zhì)可以優(yōu)先同溶液中水分子結(jié)合，降低溶液中自由水的含量，使冰點(diǎn)降低，減少冰晶的形成;同時(shí)，由于其分子量大，使溶液中電解質(zhì)濃度降低，從而減輕溶質(zhì)損傷。

　　不同的冷凍保護(hù)劑有不同的優(yōu)缺點(diǎn)。目前的趨勢(shì)是聯(lián)合使用兩種以上冷凍保護(hù)劑組合。由于許多冷凍保護(hù)劑在低溫條件下保護(hù)細(xì)胞，在常溫下對(duì)細(xì)胞有害。故在細(xì)胞復(fù)溫后要及時(shí)清除冷凍保護(hù)劑。