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離子色譜分析方法的開發(fā)步驟

[2013/2/21]

　　水合能高和疏水性弱的離子，如Cl-或K ，最好用HPIC分離。水合能低和疏水性強(qiáng)的離子，如高氯酸(ClO4-)或四丁基銨，最好用親水性強(qiáng)的離子交換分離柱或MPIC分離。有一定疏水性也有明顯水合能的pKa值在1與7之間的離子，如乙酸鹽或丙酸鹽，最好用HPICE分離。有些離子，既可用陰離子交換分離，也可用陽(yáng)離子交換分離，如氨基酸，生物堿和過(guò)渡金屬等。

　　很多離子可用多種檢測(cè)方式。例如測(cè)定過(guò)渡金屬時(shí)，可用單柱法直接用電導(dǎo)或脈沖安培檢測(cè)器，也可用柱后衍生反應(yīng)，使金屬離子與PAR或其它顯色劑作用，再用UV/VIS檢測(cè)。一般的規(guī)律是：對(duì)無(wú)紫外或可見吸收以及強(qiáng)離解的酸和堿，最好用電導(dǎo)檢測(cè)器;具有電化學(xué)活性和弱離解的離子，最好用安培檢測(cè)器;對(duì)離子本身或通過(guò)柱后反應(yīng)后生成的絡(luò)合物在紫外可見有吸收或能產(chǎn)生熒光的離子和化合物，最好用UV/VIS或熒光檢測(cè)器。若對(duì)所要解決的問(wèn)題有幾種方案可選擇，分析方案的確定主要由基體的類型、選擇性、過(guò)程的復(fù)雜程度以及是否經(jīng)濟(jì)來(lái)決定。表5-3和表5-4總結(jié)了對(duì)各種類型離子可選用的分離方式和檢測(cè)方式。

　　離子色譜柱填料的發(fā)展推動(dòng)了離子色譜應(yīng)用的快速發(fā)展，對(duì)多種離子分析方法的開發(fā)提供了多種可能性。特別應(yīng)提出的是在pH0-14的水溶液和100%有機(jī)溶劑(反相高效液相色譜用有機(jī)溶劑)中穩(wěn)定的親水性高效高容量柱填料的商品化，使得離子交換分離的應(yīng)用范圍更加擴(kuò)大。常見的在水溶液中以離子形態(tài)存在的離子，包括無(wú)機(jī)和有機(jī)離子，以弱酸的鹽(Na2CO3/NaHCO3,KOH、NaOH)或強(qiáng)酸(H2SO4、甲基磺酸、HNO3、HCl)為流動(dòng)相，陰離子交換或陽(yáng)離子交換分離，電導(dǎo)檢測(cè)，已是成熟的方法，有成熟的色譜條件可參照。對(duì)近中性的水可溶的有機(jī)“大”分子(相對(duì)常見的小分子而言)，若待測(cè)化合物為弱酸，則由于弱酸在強(qiáng)堿性溶液中會(huì)以陰離子形態(tài)存在，因此選用較強(qiáng)的堿為流動(dòng)相，陰離子交換分離;若待測(cè)化合物為弱堿，則由于在強(qiáng)酸性溶液中會(huì)以陽(yáng)離子形態(tài)存在，選用較強(qiáng)的酸作流動(dòng)相，陽(yáng)離子交換分離;若待測(cè)離子的疏水性較強(qiáng)，由于與固定相之間的吸附作用而使保留時(shí)間較長(zhǎng)或峰拖尾，則可在流動(dòng)相中加入適量有機(jī)溶劑，減弱吸附，縮短保留時(shí)間、改善峰形和選擇性。對(duì)該類化合物的分離也可選用離子對(duì)色譜分離，但流動(dòng)相中一般含有較復(fù)雜的離子對(duì)試劑。此外，對(duì)弱保留離子可選用高容量柱和弱淋洗液以增強(qiáng)保留，對(duì)強(qiáng)保留離子則反之。表5-3、表5-4列出了離子色譜中常用的兩種主要檢測(cè)器:電化學(xué)檢測(cè)器(包括電導(dǎo)和安培)和光學(xué)檢測(cè)器。在水溶液中以離子形態(tài)存在的離子，即較強(qiáng)的酸或堿，應(yīng)選用電導(dǎo)檢測(cè)器。具有對(duì)紫外或可見光有吸收基團(tuán)或經(jīng)柱后衍生反應(yīng)后(IC中較少用柱前衍生)生成有吸光基團(tuán)的化合物，選用光學(xué)檢測(cè)器。具有在外加電壓下可發(fā)生氧化或還原反應(yīng)基團(tuán)的化合物，可選用直流安培或脈沖安培檢測(cè)。對(duì)一些復(fù)雜樣品，為了一次進(jìn)樣得到較多的信息，可將兩種或三種檢測(cè)器串聯(lián)使用。

　　2 色譜條件的優(yōu)化

　　2.1 改善分離度

　　(1)稀釋樣品

　　對(duì)組成復(fù)雜的樣品，若待測(cè)離子對(duì)樹脂親合力相差頗大，就要作幾次進(jìn)樣，并用不同濃度或強(qiáng)度的淋洗液或梯度淋洗。若待測(cè)離子之間的濃度相差較大，而且對(duì)固定相親合力差異較大，增加分離度的最簡(jiǎn)單方法是稀釋樣品或做樣品前處理。例如鹽水中SO42-和Cl-的分離。若直接進(jìn)樣，在常用的分析陰離子的色譜條件下，其色譜峰很寬而且拖尾，30min之后Cl-的洗脫仍在繼續(xù)，表明進(jìn)樣量已超過(guò)分離柱容量。在這種情況下，在未恢復(fù)穩(wěn)定基線之前不能再進(jìn)樣。若將樣品稀釋10倍之后再進(jìn)樣就可得到Cl-與痕量SO42-之間的較好分離。對(duì)陰離子分析推薦的最大進(jìn)樣量，一般為靜態(tài)柱容量的30%，超過(guò)這個(gè)范圍就會(huì)出現(xiàn)大的平頭峰或肩峰。

　　表5-3分離方式和檢測(cè)器的選擇(陰離子)

　　分析離子分離方式檢測(cè)器

　　無(wú)機(jī)

　　陰離子親水性強(qiáng)酸F-、Cl-、NO2-、Br-、SO32-、NO3-、PO43-、SO42-、ClO-、ClO2-、ClO3-、BrO4-、低分子量有機(jī)酸陰離子交換電導(dǎo)、UV

　　SO32-離子排斥安培

　　砷酸鹽、硒酸鹽、亞硒酸鹽陰離子交換電導(dǎo)

　　亞砷酸鹽離子排斥安培

　　弱酸BO32-、CO32-離子排斥電導(dǎo)

　　SiO32-離子交換、離子排斥柱后衍生,VIS

　　疏水性CN-、HS-(高離子強(qiáng)度基體)

　　BF4-、S2O32-、SCN-、ClO4-、I- 離子排斥

　　陰離子交換、離子對(duì)安培

　　電導(dǎo)

　　縮合磷酸劑

　　多價(jià)螯合劑未絡(luò)合

　　已絡(luò)合陰離子交換

　　陰離子交換柱后衍生,VIS

　　電導(dǎo)

　　金屬絡(luò)合物Au(CN)2-、Au(CN)4-、Fe(CN)64-、Fe(CN)63-EDTA-Cu離子對(duì)

　　陰離子交換電導(dǎo)

　　電導(dǎo)

　　有機(jī)

　　陰離子羧酸一價(jià)脂肪酸，C<5(酸消解樣品，鹽水，高離子強(qiáng)度基體)離子排斥電導(dǎo)

　　脂肪酸，C>5芳香酸離子對(duì)/陰離子交換電導(dǎo)，UV

　　一至三價(jià)一元、二元、三元羧酸 無(wú)機(jī)陰離子

　　羥基羧酸、二元和三元羧酸 醇陰離子交換

　　離子排斥電導(dǎo)

　　電導(dǎo)

　　磺酸烷基磺酸鹽、芳香磺酸鹽離子對(duì)，陰離子交換電導(dǎo)，UV

　　醇類C<6離子排斥安培

　　表5-4分離方式和檢測(cè)器的選擇(陽(yáng)離子)

　　分析 離 子分離方式檢測(cè)器

　　無(wú)機(jī)陽(yáng)離子Li 、Na 、K 、Rb 、Cs 、Mg2 、Ca2 、Sr2 、Ba2 、NH4 陽(yáng)離子交換電導(dǎo)

　　過(guò)度金屬Cu2 、Ni2 、、Zn2 、Co2 、Cd2 、Pb2 、Mn2 、Fe2 、Fe3 、Sn2 、Sn4 、Cr3 、V4 、V5 、UO2 、Hg2

　　Al3

　　Cr6 (CrO42-)陰離子交換/陽(yáng)離子交換

　　陽(yáng)離子交換

　　陰離子交換柱后衍生VIS

　　電導(dǎo)

　　柱后衍生VIS

　　柱后衍生VIS

　　鑭系金屬La3 、Ce3 、Pr3 、Nd3 、Sm3 、Eu3 、Gd3 、Tb3 、Dy3 、Ho3 、Er3 、Tm3 、Yb3 、Lu3 陰離子交換、陽(yáng)離子交換柱后衍生VIS

　　有機(jī)陽(yáng)離子低分子量烷基胺，醇胺，堿金屬和堿土金屬陽(yáng)離子交換電導(dǎo)、安培

　　高分子量烷基胺，芳香胺，環(huán)己胺，季胺，多胺陽(yáng)離子交換，離子對(duì)電導(dǎo)、紫外、安培

　　(2)改變分離和檢測(cè)方式

　　若待測(cè)離子對(duì)固定相親合力相近或相同，樣品稀釋的效果常不令人滿意。對(duì)這種情況，除了選擇適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)相之外，還應(yīng)考慮選擇適當(dāng)?shù)姆蛛x方式和檢測(cè)方式。例如，NO3-和ClO3-，由于它們的電荷數(shù)和離子半徑相似，在陰離子交換分離柱上共淋洗。但ClO3-的疏水性大于NO3-，在離子對(duì)色譜柱上就很容易分開了。又如NO2-與Cl-在陰離子交換分離柱上的保留時(shí)間相近，常見樣品中Cl-的濃度又遠(yuǎn)大于NO2-，使分離更加困難，但NO2-有強(qiáng)的UV吸收，而Cl-則很弱，因此應(yīng)改用紫外作檢測(cè)器測(cè)定NO2-，用電導(dǎo)檢測(cè)Cl-，或?qū)煞N檢測(cè)器串聯(lián)，于一次進(jìn)樣同時(shí)檢測(cè)Cl-與NO2-。對(duì)高濃度強(qiáng)酸中有機(jī)酸的分析，若采用離子排斥，由于強(qiáng)酸不被保留，在死體積排除，將不干擾有機(jī)酸的分離。

　　(3)樣品前處理

　　對(duì)高濃度基體中痕量離子的測(cè)定，例如海水中陰離子的測(cè)定，最好的方法是對(duì)樣品作適當(dāng)?shù)那疤幚。除去過(guò)量Cl-的前處理方法有：使樣品通過(guò)Ag 型前處理柱除去Cl-，或進(jìn)樣前加AgNO3到樣品中沉淀Cl-;也可用閥切換技術(shù)，其方法是使樣品中弱保留的組分和90%以上的Cl-進(jìn)入廢液，只讓10%左右的Cl-和保留時(shí)間大于Cl-的組分進(jìn)入分離柱進(jìn)行分離。

　　(4)選擇適當(dāng)?shù)牧芟匆?

　　離子色譜分離是基于淋洗離子和樣品離子之間對(duì)樹脂有效交換容量的競(jìng)爭(zhēng)，為了得到有效的競(jìng)爭(zhēng)，樣品離子和淋洗離子應(yīng)有相近的親合力。下面舉例說(shuō)明選擇淋洗液的一般原則。用CO32-/HCO3-作淋洗液時(shí)，在Cl-之前洗脫的離子是弱保留離子，包括一價(jià)無(wú)機(jī)陰離子、短碳鏈一元羧酸和一些弱離解的組分，如F-、HCOO-、CH3COO-、AsO2-、CN-和S2-等。對(duì)HCOO-、CH3COO-、與F-、Cl-等的分離應(yīng)選用較弱的淋洗離子，常用的弱淋洗離子有HCO3-、OH-和B4O72-。由于HCO3-和OH-易吸收空氣中CO2，CO2在堿性溶液中會(huì)轉(zhuǎn)變成CO32-，CO32-的淋洗強(qiáng)度較HCO3-和OH-大，因而不利于上述弱保留離子的分離。B4O72-亦為弱淋洗離子，但溶液穩(wěn)定，是分離弱保留離子的推薦淋洗液。中等強(qiáng)度的碳酸鹽淋洗液對(duì)高親和力組分的洗脫效率低。對(duì)離子交換樹脂親合力強(qiáng)的離子有兩種情況，一種是離子的電荷數(shù)大，如PO43-、AsO43-和多聚磷酸鹽等;一種是離子半徑較大，疏水性強(qiáng)，如I-、SCN-、S2O32-，苯甲酸和檸檬酸等。對(duì)前者以增加淋洗液的濃度或選擇強(qiáng)的淋洗離子為主。對(duì)后一種情況，推薦的方法是在淋洗液中加入有機(jī)改進(jìn)劑(如甲醇、乙腈和對(duì)氰酚等)或選用親水性的柱子，有機(jī)改進(jìn)劑的作用主要是減少樣品離子與離子交換樹脂之間的非離子交換作用，占據(jù)樹脂的疏水性位置，減少疏水性離子在樹脂上的吸附，從而縮短保留時(shí)間，減少峰的拖尾，并增加測(cè)定靈敏度。

　　在離子色譜中，可由加入不同的淋洗液添加劑來(lái)改善選擇性，這種淋洗液添加劑只影響樹脂和所測(cè)離子之間的相互作用，而不影響離子交換。對(duì)與樹脂親合力較強(qiáng)的離子，如一些可極化的離子，I-和ClO4-，以及疏水性的離子，苯甲酸和三乙胺等，在淋洗液中加入適量極性的有機(jī)溶劑如甲醇或乙腈，可縮短這些組分的保留時(shí)間并改善峰形的不對(duì)稱性。為了減少樣品離子與樹脂之間的非離子交換作用，減少樹脂對(duì)疏水性離子的吸附，在陰離子分析中，可在淋洗液中加入對(duì)氰酚。如測(cè)定1%NaCl中的痕量I-和SCN-時(shí)，加入對(duì)氰酚占據(jù)樹脂對(duì)I-和SCN-的吸附位置，從而減少峰的拖尾并增加測(cè)定的靈敏度。IC中，一價(jià)淋洗離子洗脫一價(jià)待測(cè)離子，二價(jià)淋洗離子洗脫二價(jià)待測(cè)離子，淋洗液濃度的改變對(duì)二價(jià)和多價(jià)待測(cè)離子保留時(shí)間的影響大于一價(jià)待測(cè)離子。若多價(jià)離子的保留時(shí)間太長(zhǎng)，增加淋洗液的濃度是較好的方法。

　　2.2 減少保留時(shí)間

　　縮短分析時(shí)間與提高分離度的要求有時(shí)是相矛盾的。在能得到較好的分離結(jié)果的前提下分析的時(shí)間自然是越短越好。為了縮短分析時(shí)間，可改變分離柱容量、淋洗液流速、淋洗液強(qiáng)度，在淋洗液中加入有機(jī)改進(jìn)劑和用梯度淋洗技術(shù)。

　　以上方法中最簡(jiǎn)便的是減小分離柱的容量，或用短柱。例如用3×500mm分離柱分離NO3-和SO42-，需用18min，而用3×250mm的分離柱，用相同濃度的淋洗液只用9min。但NO3-和SO42-的分離不好，若改用稍弱的淋洗液就可得到較好的分離。

　　大的進(jìn)樣體積有利于提高檢測(cè)靈敏度，但導(dǎo)致大的系統(tǒng)死體積，即大的水負(fù)峰，因而推遲樣品離子的出峰時(shí)間。如在Dionex的AS11柱上用NaOH為淋洗液，進(jìn)樣量分別為25μL、250μL和750μL時(shí)，F(xiàn)-的保留時(shí)間分別為2.0min、2.5min和3.6min。為了減小保留時(shí)間，最好用小的進(jìn)樣體積。

　　增加淋洗液的流速可縮短分析時(shí)間，但流速的增加受系統(tǒng)所能承受的最高壓力的限制，流速的改變對(duì)分離機(jī)理不完全是離子交換的組分的分離度的影響較大，例如對(duì)Br-和NO2-之間的分離，當(dāng)流速增加時(shí)分離度降低很多，而分離機(jī)理主要是離子交換的NO3-和SO42-，甚至在很高的流速時(shí)，他們之間的分離度仍很好。

　　增加淋洗液的強(qiáng)度對(duì)分離度影響與縮短分離柱或增加淋洗液的流速相同。用較強(qiáng)的淋洗離子可加速離子的淋洗，但對(duì)弱保留和中等保留的離子，會(huì)降低分離度。當(dāng)用弱淋洗液(如B4O72-)分離弱保留樣品離子時(shí)，弱保留離子，如奎尼酸鹽、F-、乳酸鹽、乙酸鹽、丙酸鹽、甲酸鹽、丁酸鹽、甲基磺酸鹽、丙酮酸鹽、戊酸鹽、一氯醋酸鹽、BrO3-和Cl-等得到較好分離。但一般樣品中都含有一些對(duì)陰離子交換樹脂親合力強(qiáng)的離子，如SO42-、PO43-、草酸鹽等，如果用等濃度淋洗，它們將在一小時(shí)之后甚至更長(zhǎng)時(shí)間才被洗脫。對(duì)這種情況，應(yīng)于3-5次進(jìn)樣之后，用高濃度的強(qiáng)淋洗液作樣品進(jìn)一次樣，將強(qiáng)保留組分從柱中推出來(lái)，或者用較強(qiáng)的淋洗液洗柱子半小時(shí)。在淋洗液中加入有機(jī)改進(jìn)劑，可縮短保留時(shí)間和減小峰的拖尾。

　　2.3 改善檢測(cè)靈敏度

　　首先是按說(shuō)明書操作，是儀器在最佳工作狀態(tài)，得到穩(wěn)定的基線，才可將檢測(cè)器的靈敏度設(shè)置在較高靈敏檔，這是提高檢測(cè)靈敏度的最簡(jiǎn)單方法，但此時(shí)基線噪音也隨之增大。

　　第二種方法是增加進(jìn)樣量。直接進(jìn)樣，進(jìn)樣量的上限取決于保留時(shí)間最短的色譜峰與死體積(IC中一般稱水負(fù)峰)之間的時(shí)間，例如用IonPacCS12A柱，12mmol/L硫酸作淋洗液。進(jìn)樣體積1300μL，可直接用電導(dǎo)檢測(cè)低μg/L的堿金屬和堿土金屬，見圖5-11。圖中，Li (保留時(shí)間最小的峰)的保留時(shí)間為4.1min，水負(fù)峰在1.6min，Li 峰與水負(fù)峰之間相隔達(dá)2.5min，因此可直接用大體積進(jìn)樣。而在陰離子分析中，若用CO32-/HCO3-作流動(dòng)相，由于F-峰(保留時(shí)間最短的峰)靠近水負(fù)峰，若增加進(jìn)樣體積，水負(fù)峰增大，F(xiàn)-的峰甚至與水負(fù)峰分不開;另一方面由于F-的保留時(shí)間一般小于2min，若進(jìn)樣量大于1ml，流速為1mL/min-2mL/min，F(xiàn)-沒(méi)有足夠的時(shí)間參加色譜過(guò)程，因此峰拖尾定量困難。若用親水性強(qiáng)的固定相，以NaOH為淋洗液，特別是梯度淋洗時(shí)，由于梯度淋洗開始時(shí)NaOH濃度低，又由于通過(guò)抑制器之后的背景溶液是低電導(dǎo)的水，幾乎無(wú)水負(fù)峰，這種情況可適當(dāng)增大進(jìn)樣量，圖5-12表明，若進(jìn)樣量為1000μL可直接測(cè)定0.1μg/L的常見陰離子。

　　第三種方法是用濃縮柱，但一般只用于較清潔的樣品中痕量成分的測(cè)定，用濃縮柱時(shí)要注意，不要使分離柱超負(fù)荷。柱子的動(dòng)態(tài)離子交換容量小于理論值的30%。用濃縮柱富集F-時(shí)，若樣品中同時(shí)還含有保留較強(qiáng)的離子，如SO42-或PO43-等，F(xiàn)-的回收不好。其原因是樣品中的SO42-或PO43-也起淋洗離子的作用，可將弱保留的F-部分洗脫下來(lái)。對(duì)弱保留的離子，若濃縮柱的柱容量不是足夠大，則用加大進(jìn)樣量方法所得到的結(jié)果較用濃縮柱好。

　　第四種方法是用微孔柱。離子色譜中常用的標(biāo)準(zhǔn)柱的直徑為4mm，微孔柱的直徑為2mm。因?yàn)槲⒖字^標(biāo)準(zhǔn)柱的體積小4倍，在微孔柱中進(jìn)同樣(與標(biāo)準(zhǔn)柱)質(zhì)量的樣品，將在檢測(cè)器產(chǎn)生4倍于標(biāo)準(zhǔn)柱的信號(hào)。從動(dòng)力學(xué)的角度考慮，在相同的流動(dòng)線速度下，內(nèi)徑較大的柱子比內(nèi)徑較小的柱子有較大的洗脫體積，故樣品在內(nèi)徑較大的柱子內(nèi)被稀釋的程度較內(nèi)徑較小的柱子嚴(yán)重，另外，內(nèi)徑較小的柱子在進(jìn)行離子交換時(shí)更易洗脫，同時(shí)死體積較小，因此即使進(jìn)樣量較大也不會(huì)出現(xiàn)色譜峰嚴(yán)重拖尾的現(xiàn)象，同時(shí)可以避免使用濃縮柱時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)的由于過(guò)高的基體造成某些待測(cè)離子不能定量保留的現(xiàn)象。而且淋洗液的用量只為標(biāo)準(zhǔn)柱的四分之一，因而減少淋洗液的消耗。