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質(zhì)粒提取常見問題及解決辦法

[2013/2/27]

　　涂布棒在酒精蘸一下，然后燒一下，能不能保證把所用的菌燒死?

　　參考見解：涂布棒可以在酒精中保藏，但是酒精不能即時(shí)殺菌。蘸了酒精后再燒一小會，燒的是酒精而不是涂布棒。建議涂布棒還是干燒較長時(shí)間后，冷卻了再涂。同時(shí)作多個(gè)轉(zhuǎn)化時(shí)，應(yīng)用幾個(gè)涂布棒免得交叉污染。

　　原先測序鑒定沒有問題的細(xì)菌，37℃搖菌后發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒大小或序列出現(xiàn)異常?

　　參考見解：這種情況出現(xiàn)的幾率較小，常出現(xiàn)在較大質(zhì)；虮容^特殊的序列中。解決辦法：

　　1、降低培養(yǎng)溫度，在20～25℃下培養(yǎng)，或室溫培養(yǎng)可明顯減少發(fā)生概率。

　　2、使用一些特殊菌株，如Sure菌株，它缺失了一些重組酶，如rec類等，使得質(zhì)粒復(fù)制更加穩(wěn)定。

　　3、質(zhì)粒抽提有一個(gè)酶切不完全的原因就是溶液Ⅱ中的NaOH濃度過高造成的，請大家注意一下!

　　【有兩種方法可以在提質(zhì)粒前判斷菌生長是否正常：

　　1、利用你的嗅覺。只要平時(shí)做實(shí)驗(yàn)仔細(xì)點(diǎn)就能聞出大腸桿菌的氣味，新鮮的大腸桿菌是略帶一點(diǎn)刺鼻的氣味，但不至于反感。而在泥水狀的菌液中你只要一湊過去就感覺到其臭無比或者沒有氣味，可以和正常菌液對照。

　　2、肉眼觀察活化菌株。 對于生長不正常的菌液進(jìn)行劃板驗(yàn)證或者稀釋到濃度足夠低涂板，第二天觀察單克隆生長情況，LB平板生長的DH5A正常形態(tài)在37℃16h后直徑在1mm左右，顏色偏白，半透明狀，濕潤的圓形菌斑，如果觀察到生長過快，顏色又是泛黃的話基本上不正常了！

　　未提出質(zhì)粒或質(zhì)粒得率較低，如何解決?

　　參考見解：

　　1、大腸桿菌老化：涂布平板培養(yǎng)后，重新挑選新菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)。

　　2、質(zhì)？截悢(shù)低：由于使用低拷貝數(shù)載體引起的質(zhì)粒DNA提取量低，可更換具有相同功能的高拷貝數(shù)載體。

　　3、菌體中無質(zhì)粒：有些質(zhì)粒本身不能在某些菌種中穩(wěn)定存在，經(jīng)多次轉(zhuǎn)接后有可能造成質(zhì)粒丟失。例如，柯斯質(zhì)粒在大腸桿菌中長期保存不穩(wěn)定，因此不要頻繁轉(zhuǎn)接，每次接種時(shí)應(yīng)接種單菌落。另外，檢查篩選用抗生素使用濃度是否正確。

　　4、堿裂解不充分：使用過多菌體培養(yǎng)液，會導(dǎo)致菌體裂解不充分，可減少菌體用量或增加溶液的用量。對低拷貝數(shù)質(zhì)粒，提取時(shí)可加大菌體用量并加倍使用溶液，可以有助于增加質(zhì)粒提取量和提高質(zhì)粒質(zhì)量。

　　5、溶液使用不當(dāng)：溶液2和3在溫度較低時(shí)可能出現(xiàn)渾濁，應(yīng)置于37℃保溫片刻直至溶解為清亮的溶液，才能使用。

　　6、吸附柱過載：不同產(chǎn)品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的質(zhì)粒量很大，請分多次提取。若用富集培養(yǎng)基，例如TB或2×YT，菌液體積必須減少;若質(zhì)粒是非常高的拷貝數(shù)或宿主菌具有很高的生長率，則需減少LB培養(yǎng)液體積。

　　7、質(zhì)粒未全部溶解(尤其質(zhì)粒較大時(shí)) ：洗脫溶解質(zhì)粒時(shí)，可適當(dāng)加溫或延長溶解時(shí)間。

　　8、乙醇?xì)埩簦浩匆合礈旌髴?yīng)離心盡量去除殘留液體，再加入洗脫緩沖液。

　　9、洗脫液加入位置不正確：洗脫液應(yīng)加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會完全覆蓋硅膠膜的表面達(dá)到最大洗脫效率。

　　10、洗脫液不合適：DNA只在低鹽溶液中才能被洗脫，如洗脫緩沖液EB(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA，pH8.5)或水。洗脫效率還取決于pH值，最大洗脫效率在pH7.0-8.5間。當(dāng)用水洗脫時(shí)確保其pH值在此范圍內(nèi)，如果pH過低可能導(dǎo)致洗脫量低。洗脫時(shí)將滅菌蒸餾水或洗脫緩沖液加熱至60℃后使用，有利于提高洗脫效率。

　　11、洗脫體積太。合疵擉w積對回收率有一定影響。隨著洗脫體積的增大回收率增高，但產(chǎn)品濃度降低。為了得到較高的回收率可以增大洗脫體積。

　　12、洗脫時(shí)間過短：洗脫時(shí)間對回收率也會有一定影響。洗脫時(shí)放置1min可達(dá)到較好的效果。

　　細(xì)菌離心加入溶液I蝸旋振蕩后，發(fā)現(xiàn)菌體呈絮狀不均勻或呈細(xì)砂狀?

　　參考見解：

　　1、很可能是細(xì)菌發(fā)生溶菌，可減少培養(yǎng)時(shí)間或者試試平板培養(yǎng)，質(zhì)粒提取前用PBS將菌落洗下，相較來說固體培養(yǎng)基上細(xì)菌生長的要好一些。

　　2、質(zhì)粒抽提過程很大程度上是受細(xì)菌生長情況決定的，剛活化的菌比負(fù)80℃保存菌種所培養(yǎng)出來的菌液狀態(tài)好，保存久的菌株可能會造成質(zhì)粒濃度低，質(zhì)粒丟失等不明原因。

　　3、判斷生長的菌液是否正常，可以用肉眼觀察，在光線明亮處搖蕩新鮮培養(yǎng)液，如果發(fā)現(xiàn)菌液呈漂絮狀，情況很好。如果發(fā)現(xiàn)呈泥水狀，即看不到絮狀，只是感覺很渾濁，則可能提不出好的質(zhì)粒，或者沒有質(zhì)粒。

　　4、菌液不宜生長太濃，搖床速度不宜過高。達(dá)到OD600 1.5就可以了，(尤其是對于試劑盒提取要注意)另外如果只是簡單的酶切驗(yàn)證根本無需酚氯仿抽提(安全考慮，慎重)，只要溶液I/ II /III比例恰當(dāng)，轉(zhuǎn)管過程仔細(xì)吸取不會有太多雜志。

　　為什么加了溶液Ⅱ后，菌體沒有逐漸由混濁變澄清?提出來的條帶幾乎沒有，但是RNA很亮(沒加RNA酶)?

　　參考見解：

　　溶液Ⅱ主要就是NaOH，如果菌液沒有由混濁變澄清。

　　1、可能是因?yàn)槿芤簝Υ娌划?dāng)，或?qū)掖尾僮鳑]有及時(shí)蓋好溶液瓶蓋，導(dǎo)致其吸收空氣中的CO2失效。RNA在菌體中量較多，相對少量的菌體裂解，可有較DNA明顯的條帶。

　　2、可能是菌量大，加溶液Ⅱ后，菌體并不能完全裂解，所以沒有變清，這也會導(dǎo)致質(zhì)粒產(chǎn)率低下.

　　3、可能是質(zhì)粒的拷貝數(shù)不高，質(zhì)粒產(chǎn)率不高.如果是使用自己配的試劑，建議做中提或大提;或者買試劑盒提.用自己配的試劑，不加RNA酶，最后RNA是很亮的，要去除干凈就要用比較好的RNA酶。

　　4、如果不是試劑的原因，可能是質(zhì)粒表達(dá)的過程中使膜蛋白變化(數(shù)量變多)，很難使用堿裂解法，可以嘗試用其他比較劇烈的方法(比如高溫或者低溫研磨等),然后使用一般的發(fā)放。

　　5、可能質(zhì)粒隨乙醇一起倒掉了。

　　加入溶液II后，菌液仍然呈渾濁狀態(tài)，或者混濁度沒有明顯的改變?

　　裂解不完全,參考見解：

　　1、問題可能是發(fā)生在溶液II上。首先看看10%SDS是否是澄清的?NaOH是否是有效的?如果使用的是試劑盒，也要首先確認(rèn)溶液II是否澄清沒有沉淀?

　　2、可能是細(xì)菌濃度很高，適當(dāng)調(diào)整增加溶液I/II/III的體積。

　　3、可能是“雜菌”污染，如果菌液生長異？，就有可能被雜菌污染。這種情況一般表現(xiàn)為和目的菌有相同的抗性，生長速度異常，能夠提出質(zhì)粒，跑膠的條帶也異常的亮，但產(chǎn)物不是自己想要的質(zhì)粒，要特別注意一下。