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弱陽(yáng)離子交換色譜中疏水作用對(duì)蛋白保留的影響

[2013/3/13]

　　摘要：選取了四種常用的弱陽(yáng)離子交換(WCX)商品柱以研究標(biāo)準(zhǔn)蛋白在其上的色譜保留行為。發(fā)現(xiàn)在疏水色譜(HIC)模式下,蛋白在這四種WCX商品柱上也有不同程度的保留特征,且洗脫曲線呈現(xiàn)出保留值隨鹽濃度變化的“U”型。從分子力學(xué)角度定性解釋了因疏水相互作用力的存在影響了蛋白在WCX色譜柱上洗脫順序的改變。運(yùn)用計(jì)量置換理論(SDT)中的兩組線性方程進(jìn)一步證實(shí)了WCX和HIC中蛋白與固定相間相互作用力的性質(zhì),在HIC中為非選擇性作用力,而在離子交換色譜(IEC)中為選擇性作用力。這四種色譜柱中的兩種事實(shí)上可在WCX和HIC兩種模式下,對(duì)標(biāo)準(zhǔn)蛋白進(jìn)行分離且有較好的分離效果,有可能作為二維色譜柱來使用。

　　由于用離子交換色譜(IEC)分離后所得的蛋白能保持較高的活性,且不用昂貴和有毒的有機(jī)溶劑作流動(dòng)相,在蛋白質(zhì)科學(xué)和蛋白藥物領(lǐng)域中有著廣泛的應(yīng)用。為提高蛋白的質(zhì)量回收率,IEC的固定相表面應(yīng)具有盡可能高的親水性,以消除因疏水性對(duì)蛋白產(chǎn)生的非特異性吸附。然而眾所周知,在過去一個(gè)世紀(jì)以來所設(shè)計(jì)的一切色譜介質(zhì)都只是溶質(zhì)以一種力與其固定相的相互作用的一維色譜,一般不能滿足蛋白純化中純度大于95%的要求,故常常要用二維液相色譜(2D2LC)及多維液相色譜(mD2LC)模式進(jìn)行蛋白分離[124]。

　　Kennedy等[5]和Melander等[6]分別發(fā)現(xiàn)了陰離子交換色譜(AEX)具有疏水色譜(HIC)的性質(zhì),并稱其為混合機(jī)理。衛(wèi)引茂等[7]也發(fā)現(xiàn)了HIC柱同時(shí)具有IEC機(jī)理,統(tǒng)稱為混合保留機(jī)理。他們均繪出了能表達(dá)蛋白雙保留機(jī)理特征的“U”型洗脫曲線圖？聫挠竦萚8]用一種特殊的色譜固定相同時(shí)具有HIC和弱陽(yáng)離子交換(WCX)兩種好的色譜分離功能,從而用一根色譜柱和不同的流動(dòng)相就能實(shí)現(xiàn)通常要用兩根WCX和HIC色譜柱單獨(dú)使用的蛋白分離效果,稱該色譜柱為二維色譜柱(2Dcolumn),在此基礎(chǔ)上又提出了在線單柱二維液相色譜法(On2lineTwo2dimensionalLiquidChromatographybyaSingleColumn,On2line2D2LC21C)以實(shí)現(xiàn)天然蛋白的快速分離[9]。

　　為大大加快天然蛋白的純化速度,本文使用了四種適用范圍較廣,且具有代表性的WCX商品柱以探索其是否能成為2D色譜柱的可能性。為此,研究了它們?cè)赪CX和HIC模式下對(duì)蛋白的相互作用及分離特征。發(fā)現(xiàn)蛋白在這四種WCX柱中均存在有HIC保留機(jī)理,表明了WCX中存在疏水作用是一個(gè)普遍存在的現(xiàn)象,對(duì)蛋白分離存在著有利和不利兩方面的影響。

　　1.1主要儀器與試劑

　　高效液相色譜儀,包括兩臺(tái)泵,一臺(tái)紫外可見檢測(cè)器,手動(dòng)進(jìn)樣閥和色譜工作站;pH計(jì);超聲儀;純水儀。細(xì)胞色素c(Cytc,馬心肌)、核糖核酸酶A(RNaseA,牛胰臟)、肌紅蛋白(Myo,馬心肌)、溶菌酶(Lys,雞蛋清)、α2糜蛋白酶(α2Chy,牛胰臟)、胰島素(Ins,牛胰臟)、α2淀粉酶(α2Amy)。

　　1.2色譜條件

　　色譜柱Ⅰ:TSKgelCM25PWcolumn(75×7.5mmi.d.);色譜柱Ⅱ:Shim2packWCX21column(50×4.0mmi.d.);色譜柱Ⅲ:Shim2packWCXPA2CM(100×8.0mmi.d.);色譜柱Ⅳ:PolyCATATM(150×4.6mmi.d.)。

　　WCX流動(dòng)相A液:0.050mol/LKH2PO4(pH=6.5);B液:1.0mol/LNaCl 0.050mol/LKH2PO4(pH=6.5);線性梯度:B液0%～100%30min。HIC流動(dòng)相A液:3.0mol/L(NH4)2SO4 0.050mol/LKH2PO4(pH=6.5);流動(dòng)相B液:0.050mol/LKH2PO4(pH=6.5);線性梯度:柱Ⅰ、Ⅱ、ⅣB液0%～100%,柱ⅢB液17%～100%30min。流速1.0mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm;柱溫:室溫。