教你秒懂如何使用慢病毒

[2017/6/26]

病毒包裝是生物醫(yī)學(xué)研究中的一大利器。通過病毒我們可以高效地讓我們要研究的基因在目標(biāo)細胞中過表達或者特異性地敲低細胞中的目標(biāo)基因�？蒲兄杏玫降牟《局饕新《�、腺病毒、腺相關(guān)病毒。根據(jù)各種病毒不同的特性，不同的課題需要包裝不同的病毒。比如，腺相關(guān)病毒更適合進行動物在體研究。腺病毒具有包裝容量大、適合在體研究等有點。

生物醫(yī)學(xué)科研中使用得最多的是慢病毒，慢病毒具有外源基因容量大、目的基因整合穩(wěn)定表達、可同時感染分裂和非分裂細胞、轉(zhuǎn)染效率高的特點，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科研、臨床研究中。

1、預(yù)實驗的重要性

文獻報道或他人經(jīng)驗中的MOI（感染復(fù)數(shù)，毒粒與被感染細胞的數(shù)量比值），不僅取決于病毒對細胞本身的親噬性，而且受到不同來源重組病毒滴度測定誤差、使用保存過程損失、具體細胞狀態(tài)、傳代次數(shù)、細胞密度、具體實驗操作等方面的影響。完全照搬MOI可能并不能達到最佳效果。

傳代細胞系、原代細胞等材料，實際狀態(tài)在各個實驗室也會存在一定差異。預(yù)實驗的目的是找出能夠達到最高感染效率、同時細胞狀態(tài)未受到明顯影響的一個恰當(dāng)病毒用量。

2、預(yù)實驗安排

設(shè)置不同MOI值的感染組。可設(shè)立5、10、20、50的感染復(fù)數(shù)梯度，各兩孔，一孔加入終濃度為5 ug/ml的polybrene，另一孔不加。如果只需通過熒光顯微鏡觀察，則使用96孔板即可。如需做Real-time PCR或流式檢測則至少使用24孔板。在6 h、12 h、24h左右觀察總結(jié)感染細胞狀態(tài)，在72 h左右檢測感染效率及表達水平。如為RNAi需檢測蛋白水平下調(diào)可進一步延遲24 h。

如果有文獻報道的MOI值，可使用該值的0.5x、1x、2x、4x進行測試。如使用較難感染的細胞進行實驗，建議設(shè)置易感染細胞組如293、Hela、A549等作為陽性對照。

為了便于實驗應(yīng)用，且培養(yǎng)體系中的實際細胞數(shù)量存在計數(shù)誤差，用量預(yù)實驗的結(jié)論可總結(jié)為一定培養(yǎng)規(guī)模（如96孔板、6孔板）下、一定細胞密度時（如60%）、原始毒液加入體積（如5 μl）。當(dāng)需要放大或縮小實驗體系時，可根據(jù)培養(yǎng)面積（對應(yīng)細胞數(shù)）按比例換算得出病毒用量。

3、感染方法（以24孔板為例）

第一天，準(zhǔn)備感染細胞。在24孔板中接種目的細胞約5x10⁴/孔，每孔培養(yǎng)基體積0.5 ml。目的細胞的狀態(tài)對于感染及表達非常重要。第二天，凍存待用的病毒于冰上融化，如需稀釋毒液可以用培養(yǎng)基進行稀釋（基礎(chǔ)培養(yǎng)基或完全培養(yǎng)基均可，血清、雙抗不影響病毒感染）。觀察前一天準(zhǔn)備的細胞，狀態(tài)良好，進行病毒感染時細胞的匯合度約為50-60%左右。

按滴度計算毒液所需的用量。如原始滴度為1x10⁸TU /ml，每孔擬病毒用量為0.5x10⁶ TU，則需要使用原液5 ul。將所需用量的毒液加入完全培養(yǎng)基（500ul）、混勻，吸除孔板中原培養(yǎng)基，加入混合毒液的培養(yǎng)基。放于二氧化碳培養(yǎng)箱（37℃、5%CO₂）孵育培養(yǎng)。根據(jù)細胞狀態(tài)更換培養(yǎng)基，如狀態(tài)良好可在12-16h更換培養(yǎng)基，病毒孵育時間不短于4 h。需要使用polybrene時，在孵育培養(yǎng)基中先于毒液加入例如5 μg/ml終濃度的polybrene混勻。

按照正常培養(yǎng)基條件繼續(xù)培養(yǎng)48-72 h后可檢測感染效率。在倒置熒光顯微鏡觀察熒光，估計慢病毒感染目的細胞的效率。如載體未攜帶標(biāo)記基因的，可以通過Real-time PCR檢測目的基因表達。慢病毒表達產(chǎn)物在72-96 h左右接近高峰，如細胞生長代謝緩慢需適當(dāng)延長時間，生長旺盛的細胞在48 h即可觀察基因表達。

4、實驗參考信息

（1） 常用細胞系參考MOI值