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三分鐘帶你了解當前最熱的基因編輯技術(shù)

[2017/4/13]

基因編輯技術(shù)指能夠讓人類對目標基因進行“編輯”，實現(xiàn)對特定DNA片段的敲除、加入等。而CRISPR/Cas9技術(shù)自問世以來，就有著其它基因編輯技術(shù)無可比擬的優(yōu)勢，技術(shù)不斷改進后，更被認為能夠在活細胞中最有效、最便捷地“編輯”任何基因；蚓庉嬍且环N遺傳工程技術(shù)，針對某個序列已知但功能未知的序列，通過改變生物的遺傳基因，使其特定的基因功能喪失作用，通過研究對生物體造成的影響，進而推測出該基因的生物學功能。本文為你科普基因編輯三大技術(shù)：
　　
　　基因敲除
　　
　　進行DNA水平編輯。一般用于構(gòu)建基因敲除鼠模型。
　　
　　CRISPR/Cas9：CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為細菌和古細菌的獲得性免疫系統(tǒng)，通過RNA介導特異性的切割外源遺傳物質(zhì)，用以對抗入侵的病毒和質(zhì)粒。使用Cas9切口酶和一對sgRNA，兩個相近的切口造成DNA雙鏈斷裂，誘導細胞發(fā)生非同源末端連接修復，造成目的基因的突變。
　　
　　CRISPR/Cas9技術(shù)自問世以來，取代“鋅指核酸內(nèi)切酶（ZFN）”、“類轉(zhuǎn)錄激活因子效應物核酸酶（TALEN），成為科研、醫(yī)療等領域的有效工具”.一般通過體外轉(zhuǎn)錄得到sgRNA與cas9的mRNA，通過注射到原核期受精卵內(nèi)，移植到假孕母鼠體內(nèi)獲得基因編輯的小鼠進行基因功能研究。
　　
　　構(gòu)建方法：
　　
　　確定待敲除基因的靶位點。
　　
　　設計識別靶位點的識別的一對sgRNA。
　　
　　構(gòu)建可表達sgRNA的Cas9質(zhì)粒。
　　
　　體外轉(zhuǎn)錄sgRNA 和Cas9 RNA。
　　
　　將sgRNA和Cas9 RNA直接注射入受精卵檢測sgRNA活性。
　　
　　將有活性的sgRNA和Cas9 RNA直接注射入受精卵建立Founder。
　　
　　將Founder自交得到F1代。
　　
　　適用范圍：
　　
　　制備敲除鼠，利用敲除鼠進行基因功能的研究；進行細胞水平敲除基因時，可以選擇慢病毒載體，構(gòu)建lenticrispr-v2質(zhì)粒，通過包裝病毒進行細胞水平敲除。
　　
　　基因敲減
　　
　　RNA水平，是指通過降解具有同源序列靶基因的mRNA，達到阻止基因表達的作用。一般用于細胞水平敲減基因。
　　
　　（1）RNA干擾：
　　
　　是siRNA雙鏈結(jié)合一個核酶復合物從而形成所謂RNA誘導沉默復合物RISC。激活的RISC通過堿基配對定位到同源mRNA轉(zhuǎn)錄本上，并在距離siRNA3’端12個堿基的位置切割mRNA，該mRNA發(fā)生降解而導致基因表達沉默，是一種特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默。
　　
　　一般合成針對靶基因的siRNA，通過轉(zhuǎn)染的方法使之進入細胞內(nèi)，使靶基因沉默。這一方法受轉(zhuǎn)染效率的影響較大。目前有不少基因的siRNA已經(jīng)有商業(yè)產(chǎn)品，所以使用時買來就可以了，比較方便。
　　
　　適用范圍：
　　
　　一般通過公司合成后，通過轉(zhuǎn)染細胞進行細胞水平敲減。
　　
　。2）shRNA：
　　
　　“短發(fā)夾RNA”，shRNA包括兩個短反向重復序列，中間由一莖環(huán)（loop）序列分隔的，組成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，由polⅢ啟動子控制。隨后再連上5-6個T作為RNA聚合酶Ⅲ的轉(zhuǎn)錄終止子。
　　
　　構(gòu)建shRNA的病毒表達載體，常用的病毒載體有腺病毒載體、腺相關病毒載體、慢病毒載體等，機制與質(zhì)粒載體相似，利用了病毒感染細胞效率比較高的特點，解決了用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染效率低的缺陷。
　　
　　構(gòu)建方法：
　　
　　shRNA設計：設計RNA干擾序列是RNAi實驗的關鍵。
　　
　　載體構(gòu)建：可根據(jù)實驗需求選擇慢病毒、腺病毒載體。
　　
　　轉(zhuǎn)染細胞：常用的方法包括磷酸鈣轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電穿孔轉(zhuǎn)染等
　　
　　觀測GFP 熒光和穩(wěn)定表達細胞系篩選：可用于帶有GFP標簽的質(zhì)粒載體。
　　
　　檢測RNA 干擾效率：可以在蛋白水平或mRNA水平檢測RNA干擾效率。
　　
　　適用范圍：
　　
　　一般通過構(gòu)建慢病毒、腺病毒等進行細胞水平敲減。