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化學(xué)發(fā)光免疫分析及其進(jìn)展

[2011/7/4]

　　摘要：

　　化學(xué)發(fā)光免疫分析是將化學(xué)發(fā)光與免疫分析方法相結(jié)合，綜合了化學(xué)發(fā)光的高靈敏度和免疫分析的高選擇性，被廣泛應(yīng)用到臨床檢測(cè)和藥物分析中。隨著新的發(fā)光試劑，新固相材料的研制以及新標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用，化學(xué)發(fā)光免疫分析方法的靈敏度，重現(xiàn)性將大大提高。

　　在分析化學(xué)中，化學(xué)發(fā)光是當(dāng)基態(tài)分子吸收化學(xué)反應(yīng)中釋放的能量躍遷到激發(fā)態(tài)，處于激發(fā)態(tài)的分子以光輻射的形式返回到基態(tài)時(shí)產(chǎn)生的光。基于化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度和被測(cè)物含量之間的關(guān)系建立的分析方法叫化學(xué)發(fā)光分析法，化學(xué)發(fā)光與高效液相色譜、毛細(xì)管電泳、免疫分析等技術(shù)的結(jié)合，具有靈敏度高，線性范圍寬，儀器簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，已廣泛地應(yīng)用于環(huán)境、臨床、食品和工業(yè)分析中。將化學(xué)發(fā)光與免疫分析方法相結(jié)合，綜合了化學(xué)發(fā)光的高靈敏度和免疫分析的高選擇性，近年來(lái)，成為研究的熱點(diǎn)。

　　1化學(xué)發(fā)光免疫分析的分類(lèi)

　　化學(xué)發(fā)光免疫分析根據(jù)發(fā)光體系應(yīng)用于免疫分析中的方式不同可分為：直接標(biāo)記發(fā)光物質(zhì)的免疫分析、酶催化化學(xué)發(fā)光免疫分析和電化學(xué)發(fā)光免疫分析。

　　1.1直接標(biāo)記發(fā)光物質(zhì)的免疫分析

　　該方法是用化學(xué)發(fā)光劑直接標(biāo)記抗原或抗體。常用于標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)有吖啶酯類(lèi)化合物，是有效的發(fā)光標(biāo)記物，其通過(guò)起動(dòng)發(fā)光試劑的作用而發(fā)光，強(qiáng)烈的直接發(fā)光在1S內(nèi)完成，為快速的閃爍發(fā)光。吖啶酯作為標(biāo)記物用于免疫分析，其化學(xué)反應(yīng)簡(jiǎn)單、快速、無(wú)需催化劑;檢測(cè)小分子抗原采用競(jìng)爭(zhēng)法，大分子抗原則采用夾心法，非特異性結(jié)合少，本底低;與大分子的結(jié)合不會(huì)減小所產(chǎn)生的光量，從而增加靈敏度。張皓等采用直接化學(xué)發(fā)光技術(shù)進(jìn)行的全自動(dòng)雙抗夾心免疫測(cè)定方法，對(duì)130例患者測(cè)定血清B—HCG含量法。用化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè).HCG，操作簡(jiǎn)便、敏感度高、特異性強(qiáng)，優(yōu)于一般的酶聯(lián)免疫法和放射免疫法，適合于臨床實(shí)驗(yàn)室推廣使用。

　　1.2酶催化化學(xué)發(fā)光免疫分析

　　從標(biāo)記免疫分析角度，酶催化化學(xué)發(fā)光免疫分析應(yīng)屬酶免疫分析，只是酶反應(yīng)的底物是發(fā)光劑，操作步驟與酶免疫分析完全相同：以酶標(biāo)記生物活性物質(zhì)(如酶標(biāo)記的抗原或抗體)進(jìn)行免疫反應(yīng)，免疫反應(yīng)復(fù)合物上的酶再作用于發(fā)光底物，在信號(hào)試劑作用下發(fā)光，用發(fā)光信號(hào)測(cè)定儀進(jìn)行發(fā)光測(cè)定。目前常用的標(biāo)記酶為辣根過(guò)氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(ALP)，它們有各自的發(fā)光底物。辣根過(guò)氧化物酶常用的底物為魯米諾或其衍生物如異魯米諾，魯米諾的氧化反應(yīng)在堿性緩沖液中進(jìn)行，在過(guò)氧化物酶及活性氧(過(guò)氧化陰離子、單線態(tài)氧、羥自由基、過(guò)氧化氫)存在下，生成激發(fā)態(tài)中間體，當(dāng)其回到基態(tài)時(shí)發(fā)光，其波長(zhǎng)為425nln。鈕心怡等采用特異性的兩株C.P單克隆抗體，辣根過(guò)氧化物魯米諾酶促增敏化學(xué)發(fā)光體系，利用雙抗體夾心法檢測(cè)。敏感度為0.102 g/L;檢測(cè)線性范圍為0.102～20 L;多人次檢測(cè)證實(shí)試劑盒批內(nèi)變異均小于10%，分析間變異小于15%;與18 g/L人胰島素原、2000mIU/L的人胰島素?zé)o顯著交叉反應(yīng)。

　　堿性磷酸酶所用底物為環(huán)1，2.二氧乙烷衍生物用于化學(xué)發(fā)光酶免分析底物而設(shè)計(jì)的分子結(jié)構(gòu)中包含起穩(wěn)定作用的基團(tuán)——金剛烷基，其分子中發(fā)光基團(tuán)為芳香基團(tuán)和酶作用的基團(tuán)，在酶及起動(dòng)發(fā)光試劑作用下引起化學(xué)發(fā)光。馮艷銘等_3』采用雙抗體異位點(diǎn)一步夾心法，以甲胎蛋白單克隆抗體作為固相包被，采用改良過(guò)碘酸鈉法進(jìn)行甲胎蛋白多克隆抗體與堿性磷酸酶偶聯(lián)制備酶標(biāo)抗體;以金剛烷胺衍生物CSPD作為底物，優(yōu)化CSPD與SapphireII發(fā)光體系用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品校定定量標(biāo)準(zhǔn)品，建立了人血清AFP的化學(xué)發(fā)光免疫定量分析法。利用化學(xué)發(fā)光酶免疫分析方法，以堿性磷酸酶作為標(biāo)記物，環(huán)1，2一二氧乙烷衍生物AMPPD為發(fā)光底物，測(cè)定血清中的糖抗原50，檢出限為1.0umL～，線性范圍為0～300umL一。

　　批內(nèi)精密度<7%，批內(nèi)精密度為11%。

　　1.3電化學(xué)發(fā)光免疫分析

　　電化學(xué)發(fā)光免疫分析的反應(yīng)在電極表面進(jìn)行，發(fā)光底物為三聯(lián)吡啶釕，用另一反應(yīng)物三丙胺來(lái)激發(fā)光反應(yīng)。在陽(yáng)極表面，這兩種物質(zhì)可同時(shí)失去電子，發(fā)生氧化反應(yīng)。在電極板上二價(jià)的三聯(lián)吡啶釕迅速被氧化成三價(jià)三聯(lián)吡啶釕，與此同時(shí)三丙胺也在電極板上被氧化成三丙胺陽(yáng)離子自由基，三丙胺陽(yáng)離子自由基自發(fā)地釋放一個(gè)質(zhì)子而變成三丙胺非穩(wěn)定分子，將一個(gè)電子遞給三價(jià)三聯(lián)吡啶釕，形成激發(fā)態(tài)的二價(jià)三聯(lián)吡啶釕。激發(fā)態(tài)的二價(jià)三聯(lián)毗啶釕在衰減的同時(shí)發(fā)射一個(gè)波長(zhǎng)為620/l/n的光子，重新回到基態(tài)二價(jià)三聯(lián)吡啶釕。這一過(guò)程在電極表面反復(fù)進(jìn)行，產(chǎn)生高效、穩(wěn)定的連續(xù)發(fā)光，并不斷增強(qiáng)。張繼東用電化學(xué)發(fā)光免疫分析法在檢測(cè)乙肝標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)用電化學(xué)方法檢測(cè)，靈敏度更高，專(zhuān)屬性更強(qiáng)。

　　2新進(jìn)展

　　化學(xué)免疫分析方法的新進(jìn)展主要表現(xiàn)在新的標(biāo)記物以及標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用，新型固相載體的應(yīng)用以及聯(lián)用技術(shù)。

　　2.1新的標(biāo)記物

　　近年來(lái)，科學(xué)家們致力于化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的研究，通過(guò)往發(fā)光體系中加入增加化學(xué)增強(qiáng)劑來(lái)增加量子產(chǎn)率以及發(fā)光時(shí)間。同時(shí)一些學(xué)者將目光集中于新的標(biāo)記發(fā)光物的開(kāi)發(fā)中。并取得了相應(yīng)成果。目前已證明從棕櫚樹(shù)和大豆中提取的HRP的陰離子型同工酶(HRP2A)在沒(méi)有增強(qiáng)劑的情況下可以高效、常時(shí)間催化luminol—H2O2體系發(fā)光，并且HRP.A比HRP—C穩(wěn)定性更好，這在酶標(biāo)記物的儲(chǔ)存中是非常重要的。而白細(xì)胞堿性磷(Leukocyte Alkaline Phosphatase，LAP)與AIJP一樣，也有催化性能，并已用于化學(xué)發(fā)光的檢測(cè)。此外，還通過(guò)合成技術(shù)合成了吖啶酯類(lèi)化學(xué)發(fā)光試劑。Zhuang等合成了一種新型雙吖啶化合物：1O，102二甲基23，32二磺基29，9’2二雙吖啶(DMDSBA)，并詳細(xì)研究了它的化學(xué)發(fā)光性質(zhì)。DMDSBA被用于標(biāo)記抗一CEA抗體。標(biāo)記的比率接近1.15～1.32，平均標(biāo)記比例是1.25。結(jié)果表明，連接到抗一CEA抗體后，標(biāo)記抗體的免疫反應(yīng)活性與DMDSBA的量子效率沒(méi)有明顯改變。建立了一種新的夾心化學(xué)發(fā)光免疫方法，測(cè)定人血清中CEA的線性范圍為1.0～100ng/mL，檢測(cè)限0.53ng/mL。

　　2.2新標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用

　　固相標(biāo)記方法的應(yīng)用，減少游離標(biāo)記物以及聚合蛋白質(zhì);納米技術(shù)與生物分析的結(jié)合，即利用Au、Ag等陽(yáng)離子對(duì)化學(xué)發(fā)光具有催化放大作用，提高檢測(cè)靈敏度。HonglanQ等利用電化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，將N.氨丁基一N.異魯米諾(ABEI)作為發(fā)光標(biāo)記試劑標(biāo)記在金毫微粒改性的石蠟活化的石墨電極上，測(cè)定人體[gG。電化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度大大增強(qiáng)，ABEI檢出限為2×10-14 mol/L(S/N=3)，lgG的檢出限為1×10。g/mL(S/N=3)。線性范圍為3.0×10-ll～1.0×10-9g/mL。在濃度為1.0×10-10/mL時(shí)的RSD為3.1%。說(shuō)明金微；瘜W(xué)發(fā)光的催化放大作用在化學(xué)發(fā)光免疫分析方法中有很大的應(yīng)用前景。量子點(diǎn)(quantumdots，QDs)又稱(chēng)半導(dǎo)體納米微晶體，是一種由Ⅱ.Ⅵ族或Ⅲ.V族元素組成的能夠接受激光產(chǎn)生熒光的半導(dǎo)體納米顆粒，直徑約為2～6nm。與CLIA常用標(biāo)記酶和熒光素相比，QD不易失活，受外部環(huán)境影響小，性質(zhì)穩(wěn)定，重現(xiàn)性好激發(fā)光譜范圍寬，而發(fā)射光譜窄且對(duì)稱(chēng)，是不可多得的標(biāo)記物。

　　2.3新固相材料的應(yīng)用

　　新固相材料主要體現(xiàn)在(1)表面有與蛋白結(jié)合的官能團(tuán)，可以充分固定抗體抗原;(2)表面性質(zhì)要保證不影響結(jié)合后蛋白的免疫反應(yīng)活性;(3)比表面積要足夠大以固定足夠量蛋白(4)應(yīng)具有親水性以避免與待測(cè)物和樣品基質(zhì)的非共價(jià)結(jié)合;(5)在載液的沖擊下保持表面的抗體結(jié)合活性。目前用于丌.的固相材料主要有尼龍、瓊脂糖凝膠、磁性粒子，以及二氧化硅可控孔度玻璃(Controlled poreglass，CPG)和玻璃微珠_(kāi)IJ等有機(jī)硅材料。

　　2.4與其他技術(shù)聯(lián)用

　　目前研究最多的是毛細(xì)管電泳一化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)(CECLIA)結(jié)合了CE對(duì)生物樣品分離的高效分離和CLIA的高靈敏度檢測(cè)。王軍華等利用毛細(xì)管電泳免疫化學(xué)發(fā)光檢測(cè)鼠血管平滑肌細(xì)胞中zmol骨形成蛋白.2，采用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)催化魯米諾.過(guò)氧化氫，以對(duì)碘苯酚增強(qiáng)其化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，HRP檢出限為4.4pmol/L(53zmo1)，是目前報(bào)道檢測(cè)HRP的最高靈敏度之一。用毛細(xì)管電泳化學(xué)發(fā)光免疫方法測(cè)定了人血清中乙肝表面抗原和抗體，并與酶免疫分析方法比較，驗(yàn)證了毛細(xì)管電泳化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)用于臨床的可行性。流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析技術(shù)是將化學(xué)發(fā)光分析和流動(dòng)注射相結(jié)合的一種高靈敏度的微量及痕量分析技術(shù)，其分析速度快、器設(shè)備簡(jiǎn)單，是當(dāng)前分析化學(xué)領(lǐng)域中研究的熱點(diǎn)。利用順序流動(dòng)注射技術(shù)分析非離子型表面活性劑，線性范圍0～1000ppb，最低檢出限為10ppm每個(gè)樣品的分析時(shí)問(wèn)為15min，已經(jīng)被成功用于河水中anti-ApnEOs的檢測(cè)。

　　3結(jié)語(yǔ)

　　化學(xué)發(fā)光免疫分析方法作為一種高選擇、高靈敏度檢測(cè)方法，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用臨床檢測(cè)和藥物分析中。隨著新的發(fā)光試劑，新固相材料的研制以及新標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用，化學(xué)發(fā)光免疫分析方法的靈敏度，重現(xiàn)性將大大提高。各種聯(lián)用技術(shù)的出現(xiàn)，如毛細(xì)管電泳一化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的聯(lián)用，大大提高了化學(xué)發(fā)光免疫的選擇性和重現(xiàn)性。被廣泛應(yīng)用于臨床檢測(cè)和藥物分析中，并朝著自動(dòng)化、智能化、微型化方向發(fā)展。