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細(xì)胞培養(yǎng)中污染的清除和預(yù)防

[2011/7/23]

　　一、污染的清除

　　培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)污染，多數(shù)較難處理。如果污染細(xì)胞價值不大，宜棄之;有細(xì)胞株留存的或可購置的，可在尋找原因后徹底消毒操作室，復(fù)蘇或重新購置細(xì)胞，再培養(yǎng)。若污染細(xì)胞價值較大，又難于重新得到，可采取以下辦法清除。

　　(一)使用抗生素

　　抗生素對殺滅細(xì)菌較有效。聯(lián)合用藥比單獨用藥效果好。預(yù)防用藥比污染后再用藥效果好。預(yù)防用藥一般用雙抗生素(青霉素100u/mL加鏈霉素100μg/mL)，污染后清除用藥需采用大于常用量5～10倍的沖洗法，于加藥后作用24～48小時，再換常規(guī)培養(yǎng)液。此法在污染早期可能有效。所用抗生素品種除青霉素、鏈霉素外，還可用慶大霉素、卡那霉素、多粘菌素、四環(huán)素、制霉菌素等。常用400～800μg/mL卡那霉素或200μg/mL四環(huán)素處理，每隔2～3日換液1次，傳1～2代進(jìn)行治療。近年來有報道，4-氟，2-羥基喹啉(Ciprofloxacin,Cip)、截耳素衍生物(Pleu-romutilinderivative,BM-Cyclin2:BM-1和四環(huán)素衍生物(BM-2)等三種抗生素單用或合用對殺滅支原體有效。這三種抗生素均用PBS配成250X濃縮液，-20℃保存?zhèn)溆，使用濃度Cip為10μg/mL，BM-1為10μg/mL，BM-2為5μg/mL。使用時先吸除污染的培養(yǎng)液，加入含BM-1的RPMI1640培養(yǎng)液，3天后再吸除培養(yǎng)液，加入含BM-2的RPMI1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)4天，如此連續(xù)3個輪次，直至用33258熒光染色鏡檢證明已清除支原體后，再加正常培養(yǎng)液培養(yǎng)傳代3-4次。

　　(二)加溫處理

　　將污染的組織培養(yǎng)物放在41℃培養(yǎng)18小時，可殺死支原體，但對細(xì)胞有不良影響。所以在處理前要進(jìn)行預(yù)試驗，摸索能最大限度殺死支原體又對細(xì)胞影響最小的加熱時間。此法有時不可靠。若先用藥物處理后，再以41℃加溫處理效果更佳。

　　(三)使用支原體特異性血清

　　用5%的兔支原體免疫血清(血凝效價1:320以上)可去除支原體污染，因特異抗體可抑制支原體生長，故經(jīng)抗血清處理后11天即轉(zhuǎn)為陰性，并且5個月后仍為陰性。但此法比較麻煩，不如用抗生素方便、經(jīng)濟(jì)。

　　(四)其他方法

　　除了上述去除污染的方法外，還有動物體內(nèi)接種除菌法、巨噬細(xì)胞吞噬法、污染培養(yǎng)瓶中加溴尿嘧啶再用光照射的方法及過濾法等，但均較麻煩，且效果不確定。所以一旦支原體污染，除非有特別重要價值，一般均棄之重新培養(yǎng)。

　　二、污染的預(yù)防

　　預(yù)防是防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中發(fā)生污染的最好辦法。只有預(yù)防工作做在前，才能將發(fā)生污染的可能性降到最小程度。一般預(yù)防可從以下幾方面著手：

　　(一)從物品、用品消毒滅菌著手

　　細(xì)胞培養(yǎng)所用物品清洗、消毒要徹底，各種溶液滅菌除菌要仔細(xì)，并在無菌試驗陰性后才能使用。操作室及剩余的無菌器材要定期清潔消毒滅菌。

　　(二)從操作者做起

　　1、操作者責(zé)任心要強，要細(xì)心穩(wěn)重，操作技術(shù)要熟練。進(jìn)無菌室前要用肥皂洗手或用5%新潔爾滅浸泡5分鐘，按規(guī)定穿隔離衣。進(jìn)入后關(guān)好門，坐下來盡量少走動。工作開始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和燒灼瓶口。事先要嚴(yán)格檢查器材、溶液和培養(yǎng)物，不要把污染品或未經(jīng)消毒的物品帶入無菌室內(nèi)，更不能隨便使用，以免造成大批污染。

　　2、操作者動作要輕，必須在火焰周圍無菌區(qū)內(nèi)打開瓶口，并將瓶口轉(zhuǎn)動燒灼。操作時盡量不要談話，若打噴嚏或咳嗽應(yīng)轉(zhuǎn)向背面。

　　3、操作時要常更換吸管，切勿一根吸管做到底。一旦發(fā)現(xiàn)吸管口接觸了手和其他污染物品應(yīng)棄去。實驗完畢及時收拾，保持實驗室清潔整齊，最后用消毒水浸泡的紗布擦臺面。

　　(三)防止細(xì)胞交叉污染

　　在進(jìn)行多種細(xì)胞培養(yǎng)操作時，所用器具要嚴(yán)格區(qū)分，最好做上標(biāo)記便于辨別。并按順序進(jìn)行操作，避免一起進(jìn)行時易發(fā)生混亂。

　　在進(jìn)行換液或傳代操作時，注射器和滴管不要觸及細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶口，以免把細(xì)胞帶到培養(yǎng)液中污染其他細(xì)胞。

　　所有細(xì)胞一旦購置，或從別處引入，或自己建立，均應(yīng)及早留種凍存，一旦發(fā)生污染可棄之復(fù)蘇，重新培養(yǎng)。