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顯微攝影操作的重要注意事項(xiàng)

[2011/10/13]

　　1.　攝影者對(duì)顯微攝影裝置的調(diào)整：包括兩目鏡瞳孔間距的調(diào)整和個(gè)人屈光不正的校正。前者指將兩目鏡的距離按個(gè)人的瞳孔間距進(jìn)行調(diào)整，拉動(dòng)目鏡或捻轉(zhuǎn)瞳孔間距調(diào)節(jié)螺旋。校正屈光時(shí)應(yīng)轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡筒上的屈光度調(diào)節(jié)環(huán)，使物鏡視野中心的“十”字由單線調(diào)成雙線，達(dá)到完全清晰，并且左右眼應(yīng)分別調(diào)整。每個(gè)拍攝者都不宜省略這一步。

　　2.　物鏡與攝相目鏡不同組合的選擇：攝影目鏡除放大功能外，并不具備空間分辨功能，只有物鏡才具有空間分辨力。在一般條件下，對(duì)組織切片厚度在20 μm以下者，應(yīng)盡量選擇較高倍物鏡，例如欲放大實(shí)物50倍時(shí)，選擇“20×”物鏡配以“2.5×”目鏡的組合方式，其清晰度比“10×”物鏡及“5×”目鏡的組合方式要高些。但是也要考慮切片薄厚和觀察標(biāo)本的特異性的問(wèn)題，例如在厚度為30 μm以上的冰凍切片上，觀察蜿蜒走行的神經(jīng)纖維或血管時(shí)，由于較低倍物鏡的焦點(diǎn)深度較長(zhǎng)，有利于從不同深度、層次或角度，連續(xù)觀察分析不在同一平面上走行的神經(jīng)或血管影像。在這種情況下，還可將物鏡與目鏡不同組合多次拍攝，最終擇其效果最佳者。

　　3.　聚光器的調(diào)控使用問(wèn)題：經(jīng)驗(yàn)較少的攝影者往往缺少對(duì)聚光器高度的調(diào)節(jié)，也不知光源是否偏離視野中心。不少人只進(jìn)行了物鏡與組織切片間的所謂“上聚焦”，而沒(méi)有進(jìn)行聚光器與組織切片間的“下聚焦”，這當(dāng)然也無(wú)法獲得最佳清晰度的成像底片。 Kohler 照明法操做步驟如下：①將視場(chǎng)光闌縮至最小，使光闌葉片的通孔呈現(xiàn)其八角形影像;②兩手分別捻轉(zhuǎn)載片臺(tái)下的左右定心螺絲，使光闌影像與視場(chǎng)中心圓圈重合，以校正光路;③調(diào)節(jié)聚光器高度，使八角形光闌影像由模糊變清晰，即“下聚焦”;④散大該光闌至135幀幅邊框(指常規(guī)135型負(fù)片畫(huà)幅，24 mm×36 mm)影像外周。再次微調(diào)聚光器高度，使光闌象最清晰為止。每變換一次放大倍率時(shí)，都要重復(fù)進(jìn)行如上調(diào)整步驟。

　　4.　提高攝影反差：組織結(jié)構(gòu)對(duì)比反差的好壞，當(dāng)然取決于組織制備技術(shù)的質(zhì)量。這是提高顯微攝影質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)。但是一般情況下，為了彌補(bǔ)切片中對(duì)比反差的不足，常可采用如下的補(bǔ)救措施：①按照物鏡上的數(shù)值孔徑值即NA值，相應(yīng)地進(jìn)行聚光器孔徑光闌的匹配調(diào)節(jié)。一般質(zhì)量?jī)?yōu)良的物鏡鏡頭上，除標(biāo)有放大倍率外，同時(shí)還標(biāo)有NA值，NA值越大者空間分辨率相對(duì)越高。②如果按此法調(diào)節(jié)NA值轉(zhuǎn)盤(pán)后，若由于組織制備欠佳致使影像反差仍然不足時(shí)，則可將物鏡孔徑光闌的NA值再適當(dāng)縮小，例如10x物鏡可調(diào)至0.19等。③如經(jīng)過(guò)上述措施影像反差仍不好，則可將視場(chǎng)光闌從135(指常規(guī)135照片畫(huà)幅24 mm×36 mm)邊框外縮至邊框內(nèi)，然后在暗室擴(kuò)放時(shí)，再將視場(chǎng)光闌影像除去。當(dāng)然，上述的后兩種措施，只不過(guò)是一種稍作修正的補(bǔ)救辦法而已。

　　5.　低倍攝影難度大：低倍攝影有其特殊優(yōu)點(diǎn)，例如在1(物)×2.5(目)放大倍率下，可拍攝大鼠腦切片一側(cè)全貌，對(duì)總覽特異性標(biāo)記物的分布有一目了然之效果，但是低倍物鏡分辨力低，焦深較長(zhǎng)，利用微調(diào)螺旋進(jìn)行精確聚焦有一定難度。為避免視力的個(gè)體差異,應(yīng)采取欠焦、過(guò)焦、正焦3步,聚焦不宜反復(fù)進(jìn)行。

　　6.　油浸鏡頭的使用：100×的物鏡多為油浸鏡頭，然而，使用后常因鏡頭擦不凈而使鏡頭受損。替代的辦法是滴加超純水或雙蒸水，觀察效果與香柏油差別不大。由于100×物鏡鏡頭與切片距離極近，極易碰損鏡頭，必須先以40×物鏡聚焦，再轉(zhuǎn)至100×物鏡，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)聚焦微調(diào)螺旋至焦點(diǎn)。為避免鏡頭損傷，新型100×物鏡常有彈簧裝置，可使鏡頭微動(dòng)伸縮而避免其損傷。

　　7.　其它注意事項(xiàng): ①按照常規(guī),彩色膠卷應(yīng)加LBD(色溫變換)濾片,黑白膠卷應(yīng)加IF550(綠色)濾片。LBD濾片可使日光型彩卷獲得最佳色溫補(bǔ)償，IF550 濾片則可使黑白卷分光感度與人眼者接近。盡管有人認(rèn)為不一定需要濾光處理，但因?yàn)閿z影取決于膠片的化學(xué)感光度，并不取決于人們眼睛對(duì)視野的直觀感受，還是加濾光片為好。②曝光時(shí)間的選定，也是一個(gè)必需注意的問(wèn)題。已知在光強(qiáng)與曝光時(shí)間兩個(gè)參數(shù)之間，有許多不同的組合，均在曝光的“安全”范圍內(nèi)，但所謂的“安全”范圍，并不等于最佳條件，所以作者認(rèn)為限定曝光時(shí)間還是十分必要的，其道理在于膠卷化學(xué)感光度有一定限制，一個(gè)膠卷36個(gè)幀幅若隨意變動(dòng)曝光時(shí)間，在36張之間差異將很大，而沖洗膠卷是在同一條件下，難免有些幀幅顯影不佳。依據(jù)作者的經(jīng)驗(yàn)，曝光時(shí)間一般限定在0.5～1 s，底片的影像效果較佳。③要將重點(diǎn)拍攝的結(jié)構(gòu)置于視場(chǎng)中心，因?yàn)樽詣?dòng)曝光裝置測(cè)得的曝光時(shí)間，是以視場(chǎng)中心區(qū)為標(biāo)準(zhǔn)，而偏離中心區(qū)越遠(yuǎn)越不準(zhǔn)。有時(shí)為了兼顧結(jié)構(gòu)局解關(guān)系，而重點(diǎn)結(jié)構(gòu)又不在視場(chǎng)中心時(shí)，則可采取點(diǎn)(spot)曝光法。④若需將一張切片上的結(jié)構(gòu)拍為幾張,之后拼接時(shí),可在New Vanox 顯微攝影儀器上設(shè)有一個(gè)鎖定鍵(lock)，有利于解決這一問(wèn)題，以使同一結(jié)構(gòu)的幾個(gè)幀幅曝光時(shí)間一致，然后在洗照片時(shí)將這組照片同時(shí)放入顯影液與定影液。