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熒光PCR的分析方法

[2012/2/13]

　　對(duì)熒光定量PCR結(jié)果的分析方法我們分為兩種：絕對(duì)定量分析法和相對(duì)定量分析法。

　　1、絕對(duì)定量分析方法，起始濃度的對(duì)數(shù)跟循環(huán)數(shù)的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線由已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品繪制，根據(jù)樣品的Ct值，可求樣品的模板量。

　　(1)標(biāo)準(zhǔn)品的制備：

　　1V的樣品原液(i)+9V稀釋緩沖液，得到ii;

　　1V的ii +9V稀釋緩沖液，得到iii;

　　1V的iii + 9V稀釋緩沖液，得到iv;

　　1V的iv +9V稀釋緩沖液，得到v。

　　(2)拷貝數(shù)的計(jì)算：待測(cè)樣本濃度(ng/ul)=OD260×40*稀釋倍數(shù)

　　樣品分子量+堿基數(shù)×324

　　待測(cè)樣本拷貝數(shù)=待測(cè)樣本濃度/樣本分子量×6×1014

　　從擴(kuò)增數(shù)據(jù)得到循環(huán)數(shù)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線，我們可以求出樣品的拷貝數(shù)。

　　2.相對(duì)定量分析方法：

　　其又可有雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法和雙Ct法。所謂相對(duì)，就只是實(shí)驗(yàn)前后結(jié)果的對(duì)比，反映了反應(yīng)前后的數(shù)據(jù)的差值。

　　(1)雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法，分析簡(jiǎn)單，但是對(duì)于每一個(gè)基因，每一輪實(shí)驗(yàn)都需要做標(biāo)準(zhǔn)曲線，而且必須有特定的標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，這樣的標(biāo)準(zhǔn)品不代表樣品擴(kuò)增的真實(shí)狀態(tài)。這種方法常用于基因表達(dá)調(diào)控。

　　F=待測(cè)樣品目的基因濃度/待測(cè)樣品參照基因濃度÷對(duì)照樣品目的基因濃度/對(duì)照樣品參照基因濃度

　　(2)雙Ct法，此方法不用對(duì)看家基因和目的基因做標(biāo)準(zhǔn)曲線，而只需要對(duì)待測(cè)樣品分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增即可，標(biāo)準(zhǔn)曲線的差值<0.1.假若擴(kuò)增效率為100%或標(biāo)準(zhǔn)曲線及每次擴(kuò)增之間的效率都保持一致，這樣實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化較難為復(fù)雜。這種分析方法較長(zhǎng)用于基因表達(dá)調(diào)控研究中。