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一種簡單快速的miRNA檢測新方法

[2012/8/31]

　　“賽默飛之生物通2012實驗室創(chuàng)新技術(shù)大獎”評選活動開展以來，陸陸續(xù)續(xù)收到不少項目，這些項目中有的能減少實驗步驟，有的能降低實驗成本，還有一些改進(jìn)了實驗設(shè)備，讓我們的實驗過程更加輕松。

　　參選項目：一種簡單快速的miRNA檢測新方法----液相雜交顯色法

　　背景：MicroRNAs(miRNAs)是近年來發(fā)現(xiàn)的在進(jìn)化上高度保守的一類非編碼小RNA(~22nt)。它作為轉(zhuǎn)錄后關(guān)鍵的基因表達(dá)調(diào)控子可參與幾乎所有的生理和病理過程，革新了我們對基因表達(dá)調(diào)控的傳統(tǒng)認(rèn)識。miRNAs的檢測是其功能研究的基礎(chǔ)，但小片段的特性使其檢測十分困難。

　　PCR和Northernblot是目前檢測單個miRNA最廣泛使用的兩種方法。PCR方法敏感性高，但假陽性的憂慮和引物設(shè)計的困難限制了它的使用。Northernblot是非常有效的檢測工具，但傳統(tǒng)的固相雜交技術(shù)程序復(fù)雜、時間漫長且操作不便。新出現(xiàn)的液相雜交技術(shù)檢測速度快，但需要特定的熒光信號檢測儀器。

　　方法改進(jìn)：我們這里報道一種新的miRNA檢測方法：液相雜交顯色法(LHCD)。

　　這種方法是將提取純化的小RNA與5’端生物素標(biāo)記的DNA探針進(jìn)行液相雜交，接著用核酸外切酶消化多余的探針，再將雜交液點(diǎn)于尼龍膜上，之后ABC孵育，最后BCIP/NBP、DAB或者ECL顯色。

　　LHCD能夠區(qū)別miRNA家族成員間一個堿基的差異，其靈敏度可以達(dá)到2.5fmol，全過程耗時不到3個小時。本方法由于整合了快速液相雜交和親和素-生物素信號放大系統(tǒng)(ABC)兩大技術(shù)，不但實現(xiàn)了miRNA的簡單、快速、高靈敏度檢測，其可視化的信號目測，還省去了昂貴的信號檢測儀。此外，本方法簡單的操作流程，使其容易學(xué)習(xí)和方便使用。