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高效液相色譜法的優(yōu)點(diǎn)和常見問題

[2012/11/26]

　　高效液相色譜(HighPe-rformanceLiauidChromatography，HPLC)的主要優(yōu)點(diǎn)是：⑴分辯率高于其它色譜法⑵速度快，十幾分鐘到幾十分鐘可完成;⑶重復(fù)性高;⑷高效相色譜柱可反復(fù)使用;(5)自動化操作，分析精確度高。根據(jù)分離過程中溶質(zhì)分子與固定相相互作用的差別，高效液相色譜可分為四個基本類型，即液-固色譜、液-液色譜、離子交換色譜和體積排阻色譜。高效液相色譜在生物領(lǐng)域中廣泛用于下列產(chǎn)物的分離和鑒定：⑴氨基酸及其衍生物;⑵有機(jī)酸;⑶甾體化合物;⑷生物鹼;⑸抗菌素;⑹糖類;⑺卟啉;⑻核酸及其降解產(chǎn)物;⑼蛋白質(zhì)、酶和多肽;⑽脂類等。高效液相色譜的常見問題有：

　　1、渦流擴(kuò)散(Eddydiffusion)

　　流動相碰到較大的固體顆粒，就像流水碰到石頭一樣產(chǎn)生渦流。如果柱裝填得不均勻，有的部分松散或有細(xì)溝，則流動相的速度就快;有的部位結(jié)塊或裝直緊密則流就慢，多條流路有快有慢，就使區(qū)帶變寬。因此，固相載體的顆粒要小而均勻，裝柱要松緊均一，這樣渦流擴(kuò)散小，柱效率高。

　　2、分子擴(kuò)散(Moleculardiffusion)

　　分子擴(kuò)散就是物質(zhì)分子由濃度高的區(qū)域向濃度低的區(qū)域運(yùn)動，也稱縱向分子擴(kuò)散。要減少分子擴(kuò)散就要采用小而均勻的固相顆粒裝柱。同時在操作時，如果流速太慢，被分離物質(zhì)停留時間長，則擴(kuò)散嚴(yán)重。

　　3、質(zhì)量轉(zhuǎn)移(Masstransfer)

　　被分離物質(zhì)要在流動相與固定相中平衡，這樣才能形成較窄的區(qū)帶。在液相色譜中，溶質(zhì)分子要在兩個液相之間進(jìn)行分配，或在固相上被吸附和解吸附均需要一定的時間。當(dāng)流速快時，轉(zhuǎn)移速度慢，來不及達(dá)到平衡動相就向前移，這各物質(zhì)的非平衡移動，使區(qū)帶變寬。

　　4、動相流速

　　當(dāng)流速太低時，分子擴(kuò)散嚴(yán)重，特別是在氣相色譜中尤為突出。如將理論塔板高度對流速作圖，理論塔板高度隨流速增加而急速下降，當(dāng)達(dá)到最低值時，流速再加大則質(zhì)量轉(zhuǎn)移起主要作用，理論塔板高度又加大。在高效液相色譜中，流速稍快影響不大，但在凝膠過濾色譜中，因為物質(zhì)要滲透到凝膠內(nèi)部，所以質(zhì)量轉(zhuǎn)移影響大，流速咖大會降低柱效率。

　　5、固定相顆粒大小

　　定相顆粒越小柱效率越高，對流動相流動的阻力越大，需要加大壓力才能使它流動。