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高效液相色譜法測(cè)定豬血清中的依維菌素

[2012/12/12]

　　豬血又稱液體肉、血豆腐和血花等，味甘、苦，性溫，有解毒清腸、補(bǔ)血美容的功效。豬血富含維生素B2、維生素C、蛋白質(zhì)、鐵、磷、鈣、尼克酸等營(yíng)養(yǎng)成分。

　　建立豬血清中依維菌素(ivermectin)的高效液相色譜測(cè)定方法。方法：以0。05 偏磷酸-甲醇(7：3)沉淀豬血清蛋白后用乙酸乙酯提取依維菌素，離心后取上清液用旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)器揮干溶劑，用甲醇溶解殘?jiān)筮M(jìn)樣分析。色譜柱為反相柱(5μm，250mm×4.6mm)，流動(dòng)相為甲醇-水(90：10)，流速1ml/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為245nm 結(jié)果方法檢出下限為0.010mg/L，線性范圍為0.010～20mg/L，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差為0.78%～3.82%，加標(biāo)回收率為94.0%～100.O%。結(jié)論本法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適用于豬血清中微量依維菌素的測(cè)定。

　　「關(guān)鍵詞」高效液相色譜法;豬血清;依維菌素

　　依維菌素是一種新型高效廣譜抗寄生蟲(chóng)藥，對(duì)線蟲(chóng)、昆蟲(chóng)和螨蟲(chóng)等均有驅(qū)殺作用，可用于防治家畜和寵物的寄生蟲(chóng)病。其在體內(nèi)有一定的蓄積性，人食用了這些家畜肉制品后，依維菌素會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生危害。因此，需測(cè)定動(dòng)物血清中依維菌素的含量。對(duì)于基體簡(jiǎn)單的樣品如藥片和注射液中依維菌素含量的測(cè)定可用紫外分光光度法和高效液相色譜法。血清樣品基體復(fù)雜，干擾成分多，其測(cè)定相對(duì)困難，國(guó)外已有熒光衍生-HPLC法的報(bào)道，該法靈敏度高，但衍生化步驟繁瑣，分析成本較高。本研究利用0.05%偏磷酸-甲醇(7：3，V/V)沉淀血清蛋白、乙酸乙酯提取其中微量依維菌素，高效液相色譜法測(cè)定含量，取得了較為滿意的結(jié)果。

　　1 材料與方法

　　1。1 主要試劑及儀器

　　甲醇(色譜純);乙酸乙酯(分析純);偏磷酸(分析純);依維菌素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取0.0500g依維菌素(中國(guó)獸藥監(jiān)察所提供，批號(hào)KY31297)于25ml容量瓶中，加甲醇溶解定容，此液質(zhì)量濃度為2.00mg/ml。臨用前，用甲醇稀釋成應(yīng)用液。本實(shí)驗(yàn)用水均為純水。

　　液相色譜儀;反相色譜柱：5μm，250mm×4.6mm;色譜保護(hù)柱;紫外可見(jiàn)分光光度計(jì);離心機(jī);旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)器。

　　1。2 實(shí)驗(yàn)方法

　　1。2。1 色譜條件 流動(dòng)相：甲醇-水(90：1O)，流速1ml/min，柱溫25℃，反相C18色譜柱(5μm，250mm×4.6mm)分離，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為245nm。

　　1。2。2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 取依維菌素標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液用甲醇稀釋成0.10mg/L，0.25mg/L，0.50mg/L，1.O0mg/L，2.50mg/L，在儀器基線達(dá)到平直后，分別進(jìn)樣20μl。依維菌素保留時(shí)間為17.0min左右。以進(jìn)樣量(X，ng)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，計(jì)算線性回歸方程。本標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=1.75X一0.12，r=0.9994。

　　1。2。3 樣品處理及測(cè)定 取豬血清1.00ml置于10ml離心管中，加0.05%偏磷酸-甲醇(7：3，V/V)1.00ml，漩渦混勻，加4.00ml乙酸乙酯振搖200次提取，4000r/min離心5min。吸取乙酸乙酯層3.O0 ml于10ml離心管中，于40℃水浴下用旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)器揮干。加0.20ml甲醇旋渦振蕩1min并超聲1min溶解，4000 r/min離心5min后取上清液進(jìn)樣100μl。

　　2 結(jié)果與討論

　　2。1 色譜條件的優(yōu)化

　　2。1。1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 在200nm～400nm范圍內(nèi)，用UV-260紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)依維菌素進(jìn)行紫外掃描，其在245nm及238nm均有峰值吸收，本法選擇245nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

　　2。1。2 流動(dòng)相中甲醇比例的選擇 改變流動(dòng)相中甲醇與水的比例，觀察保留時(shí)間及峰形的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，流動(dòng)相中甲醇含量對(duì)依維菌素保留時(shí)間影響較大。甲醇含量從100%變化為90%時(shí)，保留時(shí)間從4.9min變化為17.0 min。17.0min時(shí)可將依維菌素與血清中雜質(zhì)基本分離。所以，本法選用甲醇-水(90：10)為流動(dòng)相。

　　2。1。3 柱溫的選擇 柱溫影響待測(cè)物質(zhì)與流動(dòng)相、固定相之間的分配、吸附，也影響流動(dòng)相的粘度，進(jìn)

　　而影響保留時(shí)間和峰形。比較了柱溫為20℃、25℃、30℃時(shí)的依維菌素的出峰時(shí)間及峰形，結(jié)果無(wú)明顯差別。本法選用柱溫為25℃。

　　2。2 樣品提取條件的優(yōu)化

　　2。2。1 提取溶劑的選擇 從依維菌素的分子式可以看出它是相對(duì)分子質(zhì)量大、極性小的化合物，應(yīng)選用極性小的有機(jī)溶劑進(jìn)行提取。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在相同的條件下，乙酸乙酯的提取效率為94.3%;二氯甲烷的提取效率為26.7%。正己烷、乙醚的提取效率為74.0%。故選用乙酸乙酯作為提取劑。2.00ml乙酸乙酯的提取效率小于70%，4.00ml提取效率為94.3%，本法選用4.00ml乙酸乙酯進(jìn)行提取。

　　2。2。2 沉淀劑及其用量的選擇 根據(jù)文獻(xiàn)，本法選用0.05%偏磷酸-甲醇(7：3，V/V)為血清蛋白沉淀劑，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該沉淀劑沉淀效果好，回收率高。本法選用該沉淀劑用量為1.00ml。

　　2。3 方法考察及性能實(shí)驗(yàn)

　　2。3。1 檢出限和線性范圍 以兩倍信噪比計(jì)算本法樣品的檢出下限為0.010mg/L。本法線性范圍至少為0.010～20mg/L。

　　2。3。2 方法精密度將三種質(zhì)量濃度(0.25mg/L，1.O0mg/L，2.50mg/L)標(biāo)準(zhǔn)溶液于同一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，得日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差。

　　2。3。3 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn) 可見(jiàn)，本法回收率范圍為94.0%～100.0%，平均為97.3%。

　　2。4 方法應(yīng)用

　　3 討論

　　常用于評(píng)價(jià)收縮和舒張功能的指標(biāo)如射血分?jǐn)?shù)、二尖瓣前向血流E/A及等容舒張時(shí)間，都不同程度地受到心率、心臟前后負(fù)荷及心臟幾何形態(tài)的影響。當(dāng)心室收縮不一致時(shí)，射血分?jǐn)?shù)反映心功能有局限性。心臟功能不全時(shí)心臟收縮和舒張功能異常常合并存在，因此綜合評(píng)價(jià)心臟的整體功能更加合理。心肌運(yùn)動(dòng)指數(shù)，即Tei指數(shù)，是一個(gè)重要的綜合收縮功能和舒張功能的多普勒參數(shù)，不受左室?guī)缀涡螒B(tài)及心率的影響。國(guó)外系列報(bào)道證明心肌運(yùn)動(dòng)指數(shù)在評(píng)價(jià)充血性心力衰竭、擴(kuò)張型心肌病及先心病等患者的心室功能方面有重要的臨床價(jià)值。

　　本研究中無(wú)冠脈狹窄組的心肌運(yùn)動(dòng)指數(shù)在0.47士0.05，冠脈狹窄組的心肌運(yùn)動(dòng)指數(shù)高于沒(méi)有冠脈狹窄組，與Dagdelen的結(jié)果相似。此外可見(jiàn)心肌運(yùn)動(dòng)指數(shù)有隨狹窄冠脈支數(shù)增加而增加的趨勢(shì)，反映左室整體功能隨狹窄冠脈范圍擴(kuò)大而降低。狹窄冠脈的范圍及心肌缺血范圍對(duì)預(yù)后有重要影響，本研究中4組病例的射血分?jǐn)?shù)均在正常范圍內(nèi)，沒(méi)有差異，可以看出心肌運(yùn)動(dòng)指數(shù)能更敏感地反映左室整體功能的改變，提示心臟功能的早期改變，利于臨床干預(yù)。因此，認(rèn)為心肌運(yùn)動(dòng)指數(shù)能有效地反映不同狹窄范圍冠脈和缺血區(qū)域的左室整體功能變化，能更好地反映心功能，預(yù)示預(yù)后。由于樣本量較小，本研究未能將冠心病患者分為心絞痛組和心肌梗死組，這有待于進(jìn)一步研究。