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高效液相色譜分析原理及流程

[2013/1/11]

　　高效液相色譜以經(jīng)典的液相色譜為基礎(chǔ)，是以高壓下的液體為流動相的色譜過程。通常所說的柱層析、薄層層析或紙層析就是經(jīng)典的液相色譜。所用的固定相為大于100um的吸附劑(硅膠、氧化鋁等)。這種傳統(tǒng)的液相色譜所用的固定相粒度大，傳質(zhì)擴(kuò)散慢，因而柱效低，分離能力差，只能進(jìn)行簡單混合物的分離。而高效液相所用的固定相粒度小(5um-10um)、傳質(zhì)快、柱效高。高效液相色譜法(HPLC)是20世紀(jì)60年代后期發(fā)展起來的一種分析方法。近年來，在保健食品功效成分、營養(yǎng)強(qiáng)化劑、維生素類、蛋白質(zhì)的分離測定等應(yīng)用廣泛。世界上約有80%的有機(jī)化合物可以用HPLC來分析測定。

　　高效液相色譜分析原理

　　(一)高效液相色譜分析的流程

　　由泵將儲液瓶中的溶劑吸入色譜系統(tǒng)，然后輸出，經(jīng)流量與壓力測量之后，導(dǎo)入進(jìn)樣器。被測物由進(jìn)樣器注入，并隨流動相通過色譜柱，在柱上進(jìn)行分離后進(jìn)入檢測器，檢測信號由數(shù)據(jù)處理設(shè)備采集與處理，并記錄色譜圖。廢液流入廢液瓶。遇到復(fù)雜的混合物分離(極性范圍比較寬)還可用梯度控制器作梯度洗脫。這和氣相色譜的程序升溫類似，不同的是氣相色譜改變溫度，而HPLC改變的是流動相極性，使樣品各組分在最佳條件下得以分離。

　　(二)高效液相色譜的分離過程

　　同其他色譜過程一樣，HPLC也是溶質(zhì)在固定相和流動相之間進(jìn)行的一種連續(xù)多次交換過程。它借溶質(zhì)在兩相間分配系數(shù)、親和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差別使不同溶質(zhì)得以分離。開始樣品加在柱頭上，假設(shè)樣品中含有3個(gè)組分，A、B和C，隨流動相一起進(jìn)入色譜柱，開始在固定相和流動相之間進(jìn)行分配。分配系數(shù)小的組分A不易被固定相阻留，較早地流出色譜柱。分配系數(shù)大的組分C在固定相上滯留時(shí)間長，較晚流出色譜柱。組分B的分配系數(shù)介于A，C之間，第二個(gè)流出色譜柱。若一個(gè)含有多個(gè)組分的混合物進(jìn)入系統(tǒng)，則混合物中各組分按其在兩相間分配系數(shù)的不同先后流出色譜柱，達(dá)到分離之目的。

　　不同組分在色譜過程中的分離情況，首先取決于各組分在兩相間的分配系數(shù)、吸附能力、親和力等是否有差異，這是熱力學(xué)平衡問題，也是分離的首要條件。其次，當(dāng)不同組分在色譜柱中運(yùn)動時(shí)，譜帶隨柱長展寬，分離情況與兩相之間的擴(kuò)散系數(shù)、固定相粒度的大小、柱的填充情況以及流動相的流速等有關(guān)。所以分離最終效果則是熱力學(xué)與動力學(xué)兩方面的綜合效益。

　　高效液相色譜的類型

　　(一)吸附色譜

　　在吸附色譜中，樣品的極性官能團(tuán)牢固地保留在填料的吸附活性中心上，非極性烴基幾乎不予保留。所以，要清楚地辨別極性功能團(tuán)的種類、數(shù)量和位置。通常，樣品能用吸附色譜分離的應(yīng)是能溶解于有機(jī)溶劑并是非離子型的，強(qiáng)離子樣品是不適宜的。

　　吸附色譜所使用的流動相以正己烷、三氯甲烷、二氯甲烷作為基礎(chǔ)，按照樣品的極性加上乙醇，然而，最好是使所加入醇的濃度為10%或更少一些。如有可能，可進(jìn)一步減小百分?jǐn)?shù)。因?yàn)楦邼舛鹊拇紩䴗p少填料的吸附活性，減弱吸附能力，并使重現(xiàn)困難。

　　(二)分配色譜

　　1.正相分配色譜

　　正相分配色譜適用于不溶于水而溶于有機(jī)溶劑且?guī)в袠O性基團(tuán)的樣品，但正相分配色譜不適合于離子型物質(zhì)。

　　2.反相分配色譜

　　這種方法目前應(yīng)用非常廣泛，應(yīng)用的范圍也很廣，在反相分配色譜中，樣品的非極性部分起保留作用。

　　通過使用的流動相是水—甲醇和水—乙腈，通過加入甲醇或乙腈的量的不同來調(diào)節(jié)分離，但如果樣品帶有離子型基團(tuán)，需要在流動相中加入鹽或調(diào)節(jié)流動相的PH值，例如，如果樣品有一個(gè)—COOH基團(tuán)，使流動相的PH值是偏向酸性的，由于抑制了—COOH基團(tuán)的電離而加強(qiáng)了保留。這個(gè)方法叫離子抑止法，如果樣品有強(qiáng)離子基，有時(shí)候采用在流動相中加入適當(dāng)抗衡離子以形成離子對的離子對法。

　　在調(diào)節(jié)PH值中，保持PH值在填料說明書手冊中所規(guī)定的范圍內(nèi)，大多數(shù)化學(xué)鍵式的二氧化硅使用在PH=2-9，然而，當(dāng)加入鹽以后，最好使其PH=7.5-8或更小的，多孔聚合物填料能應(yīng)用非常廣泛的PH值。

　　(三)離子交換色譜

　　這個(gè)方法是用填料的固定相的離子交換基團(tuán)和樣品的離子基團(tuán)之間的離子交換來分離樣品組分的，按照所交換的離子分成陽離子交換和陰離子交換。

　　離子交換色譜使用于能溶于水的離子型物質(zhì)。在離子交換色譜中，流動相的鹽的濃度、PH及鹽的種類等都對保留值有很大的影響。在高效液相色譜的離子交換中所用的鹽有磷酸鹽、醋酸鹽和硼酸鹽。因?yàn)槁然飼g不銹鋼儀器，在高效液相色譜中不能使用NaCI或其他的氯化物鹽類。根據(jù)測量波長有些鹽也不能使用，例如，醋酸吸收大約在210nm，當(dāng)檢測處在短波端的時(shí)候，用醋酸作流動相是不合適的。

　　(四)凝膠色譜

　　凝膠色譜不同于以上三種分離方法。凝膠色譜是根據(jù)分子大小用分子篩效應(yīng)來分離樣品組分的。這個(gè)方法也叫排阻色譜或粒度排阻色譜。具有一定孔徑的多孔性合成聚合物經(jīng)常用作填料。

　　因?yàn)樵跇悠分，小尺寸的分子深深地滲透到微孔中，所以遲流出，而大尺寸的分子沒有滲透到微孔中，就很快流出。通常合成樹脂的分離使用有機(jī)溶劑作流動相，叫做凝膠滲透色譜。

　　凝膠色譜依樣品的性質(zhì)又可分為凝膠滲透和凝膠過濾。

　　1.凝膠滲透色譜

　　凝膠滲透色譜(GelPermeationChromatography)，簡稱GPC。此一類的色譜，使用于有機(jī)性溶媒的樣品中，如PVC，PS，ABS等等，而所用的洗脫液有THF，Chloroform等等。

　　2.凝膠過濾色譜

　　凝膠過濾色譜(GelFiltrarionChromatography)，簡稱GFC。此一種類的層析法，使用于水溶媒的試劑中，如蛋白質(zhì)、淀粉及水性合成高分子等等，而所用的溶液有水、緩沖液等等。

　　凝膠的種類很多，按其原料來源可分為有機(jī)膠和無機(jī)膠。按其制備的方法又可分為均勻、半均勻和非均勻三種凝膠。而根據(jù)凝膠的強(qiáng)度又可分為軟膠、半硬膠和硬膠三大類。根據(jù)它對溶劑的適用范圍又可分為親水性、親油性和兩性凝膠等等。