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細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)原理及應(yīng)用

[2013/3/16]

　　常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)可分為兩大類,一類是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,一類是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染(永久轉(zhuǎn)染).前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中,因此一個(gè)宿主細(xì)胞中可存在多個(gè)拷貝數(shù),產(chǎn)生高水平的表達(dá),但通常只持續(xù)幾天,多用于啟動(dòng)子和其它調(diào)控元件的分析.一般來說,超螺旋質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率較高,在轉(zhuǎn)染后24-72小時(shí)內(nèi)(依賴于各種不同的構(gòu)建)分析結(jié)果,常常用到一些報(bào)告系統(tǒng)如熒光蛋白,β半乳糖苷酶等來幫助檢測(cè).后者也稱穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,外源DNA既可以整合到宿主染色體中,也可能作為一種游離體(episome)存在.盡管線性DNA比超螺旋DNA轉(zhuǎn)入量低但整合率高.外源DNA整合到染色體中概率很小,大約1/104轉(zhuǎn)染細(xì)胞能整合,通常需要通過一些選擇性標(biāo)記,如來氨丙基轉(zhuǎn)移酶(APH;新霉素抗性基因),潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPH),胸苷激酶(TK)等反復(fù)篩選,得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細(xì)胞系。

　　轉(zhuǎn)染技術(shù)的選擇對(duì)轉(zhuǎn)染結(jié)果影響也很大,許多轉(zhuǎn)染方法需要優(yōu)化DNA與轉(zhuǎn)染試劑比例,細(xì)胞數(shù)量,培養(yǎng)及檢測(cè)時(shí)間等.一些傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染技術(shù),如DEAE右旋糖苷法,磷酸鈣法,電穿孔法,脂質(zhì)體法各有利弊,其主要原理及應(yīng)用特點(diǎn)如下：

　　磷酸鈣法

　　磷酸鈣DNA復(fù)合物吸附細(xì)胞膜被細(xì)胞內(nèi)吞 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

　　瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染 不適用于原代細(xì)胞

　　操作簡(jiǎn)便但重復(fù)性差

　　有些細(xì)胞不適用

　　DEAE-右旋糖苷法

　　帶正電的DEAE-右旋糖苷與核酸帶負(fù)電的磷酸骨架相互作用形成的復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞 瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染 相對(duì)簡(jiǎn)便、結(jié)果可重復(fù) 但對(duì)細(xì)胞有一定的毒副作用 轉(zhuǎn)染時(shí)需除血清

　　電穿孔法

　　高脈沖電壓破壞細(xì)胞膜電位,DNA通過膜上形成的小孔導(dǎo)入 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染

　　所有細(xì)胞 適用性廣但細(xì)胞致死率高,DNA和細(xì)胞用量大, 需根據(jù)不同細(xì)胞類型優(yōu)化電穿孔實(shí)驗(yàn)條件

　　病毒介導(dǎo)法

　　通過侵染宿主細(xì)胞將外源基因整合到染色體中 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、原代細(xì)胞,體內(nèi)細(xì)胞等

　　逆轉(zhuǎn)錄病毒

　　特定宿主細(xì)胞 但攜帶基因不能太大細(xì)胞需處分裂期 需考慮安全因素

　　腺病毒

　　通過侵染宿主細(xì)胞將外源基因整合到染色體中 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 特定宿主細(xì)胞 可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞

　　需考慮安全因素

　　陽離子脂質(zhì)體法 帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染

　　所有細(xì)胞 適用性廣,轉(zhuǎn)染效率高,重復(fù)性好,但轉(zhuǎn)染時(shí)需除血清.轉(zhuǎn)染效果隨細(xì)胞類型變化大

　　Biolistic顆粒傳遞法

　　將DNA用顯微重金屬顆粒沉淀,再將包被好的顆粒用彈道裝置投射入細(xì)胞,DNA在胞內(nèi)逐步釋放,表達(dá) 瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染 可用于：人的表皮細(xì)胞,纖維原細(xì)胞,淋巴細(xì)胞系以及原代細(xì)胞

　　顯微注射法

　　用顯微操作將DNA直接注入靶細(xì)胞核 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)有限

　　多用于工程改造或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的胚胎細(xì)胞

　　各種轉(zhuǎn)染方法的比較：

　　除上述傳統(tǒng)方法外,近年來國際上推出了一些陽離子聚合物基因轉(zhuǎn)染技術(shù),以其適用宿主范圍廣,操作簡(jiǎn)便,對(duì)細(xì)胞毒性小,轉(zhuǎn)染效率高受到研究者們的青睞.其中樹枝狀聚合物(Dendrimers)和聚乙烯亞胺(Polyethylenimine,PEI)的轉(zhuǎn)染性能最佳,但樹枝狀聚合物的結(jié)構(gòu)不易于進(jìn)一步改性,且其合成工藝復(fù)雜.聚乙烯亞胺是一種具有較高的陽離子電荷密度的有機(jī)大分子,每相隔二個(gè)碳個(gè)原子,即每“第三個(gè)原子都是質(zhì)子化的氨基氮原子,使得聚合物網(wǎng)絡(luò)在任何pH下都能充當(dāng)有效的“質(zhì)子海綿”(proton sponge)體.這種聚陽離子能將各種報(bào)告基因轉(zhuǎn)入各種種屬細(xì)胞,其效果好于脂質(zhì)聚酰胺,經(jīng)進(jìn)一步的改性后,其轉(zhuǎn)染性能好于樹枝狀聚合物,而且它的細(xì)胞毒性低.大量實(shí)驗(yàn)證明,PEI是非常有希望的基因治療載體.目前在設(shè)計(jì)更復(fù)雜的基因載體時(shí),PEI經(jīng)常做為核心組成成分。

　　線型PEI(Line PEI,LPEI)與其衍生物用作基因轉(zhuǎn)染載體的研究比分枝狀PEI(Branched PEI,BPEI)要早一些,過去的研究認(rèn)為在不考慮具體條件,LPEI/DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物的細(xì)胞毒性較低,有利于細(xì)胞定位,因此與BPEI相比應(yīng)該轉(zhuǎn)染效率高一些.但最近研究表明BPEI的分枝度高有利于形成小的轉(zhuǎn)染復(fù)合物,從而提高轉(zhuǎn)染效率,但同時(shí)細(xì)胞毒性也增大.超高分枝的、較柔性的PEI衍生物含有額外的仲胺基和叔胺基,在染實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)這種PEI的毒性低,但轉(zhuǎn)染效率卻較高。

　　GenEscort是采用各種分枝狀和超高分枝狀的小分子PEI與各種含有生理?xiàng)l件下可降解鍵的交聯(lián)劑交聯(lián),合成出的一系列高分枝的可降解的PEI衍生物.聚合物的分枝結(jié)構(gòu)使得其具有較高的正電性,因此易于高效地包裹各種DNA、RNA分子及質(zhì)粒形成小的納米顆粒,從而提高轉(zhuǎn)染效率,當(dāng)所形成復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞以后,其中所含的生理?xiàng)l件下可降解的化學(xué)鍵在細(xì)胞內(nèi)水解,使交聯(lián)聚合物分解為無細(xì)胞毒性的小分子PEI,這樣結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)染試劑在體外應(yīng)用可以獲得高的轉(zhuǎn)染效率和低的細(xì)胞毒性,其可降解性對(duì)體內(nèi)應(yīng)用也具有重要的意義。