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免疫組化染色中“雜音”染色片的種類及解決辦法

[2013/3/18]

　　免疫組化除正常的真實(shí)的陽(yáng)性信號(hào)外常常會(huì)遇到不正常的背景著色，這些非正常的著色稱為“雜音”染色。“雜音”染色種類繁多，產(chǎn)生的原因也多種多樣，為了便于說明，筆者將其歸納為下面幾種。

　　1、全片著色

　　全片著色是指整個(gè)切片全都染上了顏色，著色的強(qiáng)度可深可淺，總之，分不清那些組織是陽(yáng)性那些組織是陰性。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因有：

　　(1)抗體濃度過高：一抗?jié)舛冗^高是常見的原因之一。解決辦法是，每次使用新抗體前應(yīng)當(dāng)對(duì)其工作濃度進(jìn)行測(cè)試，使每一抗體個(gè)體化，找到適合自己實(shí)驗(yàn)室的理想工作濃度，既使是即用型的抗體也應(yīng)如此，不能只簡(jiǎn)單的按說明書進(jìn)行染色。

　　(2)抗體孵育時(shí)間過長(zhǎng)或溫度較高：解決辦法是，嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程，最好隨身佩帶報(bào)時(shí)表或報(bào)時(shí)鐘，及時(shí)提醒，避免因遺忘而造成時(shí)間延長(zhǎng)。現(xiàn)在流行的二步法(Polymer)敏感性很高，要求一抗孵育的時(shí)間不是傳統(tǒng)的1小時(shí)，而是30分鐘，因此，要根據(jù)染色結(jié)果進(jìn)行調(diào)整。

　　(3)DAB變質(zhì)和顯色時(shí)間太長(zhǎng)：DAB最好現(xiàn)用現(xiàn)配，如有沉渣應(yīng)進(jìn)行過濾后再用。配制好的DAB不應(yīng)存放時(shí)間太長(zhǎng)，因?yàn)樵跊]有酶的情況下，過氧化氫也會(huì)游離出氧原子與DAB產(chǎn)生反應(yīng)而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里幾天后再用這種似乎節(jié)約的辦法是不可取的。DAB的顯色最好在顯微鏡下監(jiān)控，達(dá)到理想的染色程度時(shí)立即終止反應(yīng)。不過當(dāng)染色片太多時(shí)或用染色機(jī)時(shí)，這樣做似乎不現(xiàn)實(shí)，但至少應(yīng)對(duì)一些新的或少用的抗體顯色時(shí)進(jìn)行監(jiān)控，避免顯色時(shí)間過長(zhǎng)。

　　(4)組織變干：修復(fù)液溢出后未及時(shí)補(bǔ)充液體、染色切片太多、動(dòng)作太慢、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織變干的原因。解決的辦法是操作要認(rèn)真仔細(xì)，采用DAKO筆或PAPPen在組織周圍畫圈，可以有效的避免液體流失，也能提高操作速度。

　　(5)切片在緩沖液或修復(fù)液中浸泡時(shí)間太長(zhǎng)(大于24小時(shí))：原因上不清楚，但現(xiàn)象存在。有的實(shí)驗(yàn)室喜歡前一天將切片脫蠟至修復(fù)，第二天加抗體進(jìn)行免疫組化染色，如果將裝有切片和修復(fù)液的容器放在4度冰箱過夜，對(duì)結(jié)果無(wú)明顯影響，如果放在室溫，特別是炎熱的夏天，會(huì)出現(xiàn)背景著色，因此，不可存放時(shí)間太長(zhǎng)。

　　(6)一抗變質(zhì)、質(zhì)量差的多克隆抗體：注意抗體的有效期，過期的抗體要麼不顯色要麼背景著色。用新買的抗體時(shí)最好設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和用使用過的抗體作比較。

　　2、“陰陽(yáng)臉”著色

　　指組織一半著色一半無(wú)著色，形成交界清晰或不甚清晰的兩種染色結(jié)果。其成因是試劑僅覆蓋了部分組織而不是全部。如加試劑后未讓試劑流散開而集中在部分組織上。通常應(yīng)該在加完試劑后，仔細(xì)看一遍，是否有的組織未被試劑完全覆蓋，如有這種情況，建議用牙簽而不是用吸頭或試劑瓶口將試劑引流開使之將組織全部覆蓋。另外，染片盒不平，切片傾斜，雖然開始試劑已全部覆蓋了組織，但后來(lái)試劑流向一邊，部分組織未被試劑覆蓋。對(duì)于這種問題，只要留心或想到了很容易發(fā)現(xiàn)，也很容易解決。有時(shí)，用DAKO(或PAP)筆在組織周圍畫圈時(shí)，劃線太靠近或畫到了組織上，由于筆油的力學(xué)原理，試劑不能達(dá)到靠近劃線附近的組織。還有氣泡也可引起陰陽(yáng)分明的著色，只是不著色區(qū)域是圓形，由于氣泡中含氣，試劑被推到周圍，因此，氣泡中心的組織不著色。解決辦法是滴加試劑時(shí)手法要輕，有氣泡時(shí)用牙簽捅破。

　　3、切片邊緣著色

　　切片邊緣著色也是一種常見的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象稱為邊緣效應(yīng)。產(chǎn)生的原因：(1)組織邊緣與玻片粘貼不牢，邊緣組織松脫漂浮在液體，每次清洗不易將組織下面試劑洗盡所致。解決辦法：制備優(yōu)質(zhì)的膠片(APES或多聚賴氨酸)，切出盡量薄的組織切片，不厚于4微米，組織的前期處理應(yīng)規(guī)范，盡量避免選用壞死較多的組織。(2)切片上滴加的試劑未充分覆蓋組織，邊緣的試劑容易首先變干，濃度較中心組織高而致染色深。解決辦法：試劑要充分覆蓋組織，應(yīng)超出組織邊緣 2 mm。用DAKO筆畫圈時(shí)，為了避免油劑的影響，畫圈應(yīng)距組織邊緣3-4 mm。

　　4、灶片狀著色

　　切片中著色區(qū)東一塊西一塊，呈灶片狀分布，出現(xiàn)這種問題的原因有：(1)裱片時(shí)水未排盡，在局部形成氣泡使組織突起，染色時(shí)試劑滲入后不易洗盡，顯色過深所致。解決辦法是，漂片盒里的氣泡應(yīng)去盡，晾片熱臺(tái)不能平放，應(yīng)有45度左右的斜度，利于水流走和蒸發(fā)。(2)壞死組織灶，組織壞死后細(xì)胞破壞、酶的釋放、蛋白游離、分解，復(fù)雜的肽鏈殘段(如Fc段)可能與一抗或/和二抗結(jié)合導(dǎo)致最終著色。解決辦法是在選擇染色切片時(shí)應(yīng)避免選擇壞死組織較多的切片。(3)制作APES膠片時(shí)，膠的濃度太高，干燥后在玻片上留下白色小點(diǎn)，顯色時(shí)白色小點(diǎn)著色。解決辦法是按照標(biāo)準(zhǔn)的制備方法進(jìn)行，即5%鹽酸酒精(5 ml鹽酸+95%酒精95 ml)浸泡玻片4小時(shí)、熱水沖洗玻片1小時(shí)、蒸餾水洗玻片1分鐘、丙酮浸泡玻片5秒鐘后空氣干燥(室溫)、2% APES(2 ml APES+98 ml丙酮)浸泡玻片5分鐘、玻片過一下丙酮(1-2秒鐘)、玻片過一下蒸餾水(1-2秒鐘)、37 度過夜干燥、室溫儲(chǔ)存?zhèn)溆。如果制片過程中，因丙酮逐漸揮發(fā)而膠變濃時(shí)可適當(dāng)加入一些丙酮。

　　5、細(xì)胞漿著色

　　胞漿著色是所有“雜音”染色中最具有欺騙性的著色，著色區(qū)局限在細(xì)胞內(nèi)，間質(zhì)無(wú)著色，看上去與真實(shí)的免疫反應(yīng)著色幾乎一樣，很難區(qū)別。胞漿里含有較多的蛋白質(zhì)，因此，很多非特異性的染色除了見于間質(zhì)也可以出現(xiàn)在胞漿中。這種原因造成的著色，可以通過血清封閉解決。還有因內(nèi)源酶造成的著色，如血紅蛋白(紅細(xì)胞)、肌紅蛋白(肌細(xì)胞)、細(xì)胞色素(粒細(xì)胞、單核細(xì)胞)、過氧化氫酶(肝、腎)，這些可用過氧化氫進(jìn)行封閉。巨噬細(xì)胞吞噬各種抗原物質(zhì)或Fc片斷而出現(xiàn)胞漿著色，這種著色不易避免，但可以通過形態(tài)學(xué)辨認(rèn)出巨噬細(xì)胞而引起重視。內(nèi)源性生物素的著色最具有欺騙性，因?yàn)樗鼜V泛的存在于組織細(xì)胞中，我們研究結(jié)果顯示：冰凍組織中存在內(nèi)源性生物素，經(jīng)福馬林固定石蠟包埋后生物素被封閉，加熱抗原修復(fù)后造成內(nèi)源性生物素暴露，內(nèi)源性生物素暴露的強(qiáng)度在不同的組織有所不同，從弱陽(yáng)性(+)到強(qiáng)陽(yáng)性(+++)，內(nèi)源性生物素在組織中的分布形式，既有散在分布也有彌漫分布，主要以顆粒狀形式存在于胞漿中，內(nèi)源性生物素廣泛存在于上皮源性組織，特別是腺上皮組織，亦存在部分非上皮組織，內(nèi)源性生物素不僅存在人體組織也存在大鼠組織，內(nèi)源性生物素暴露的強(qiáng)弱與修復(fù)液有關(guān)，其強(qiáng)度增加依次為：檸檬酸、EDTA、EGTA，熱抗原修復(fù)暴露的內(nèi)源性生物素可被雞蛋清封閉，非生物素檢測(cè)系統(tǒng)Polymer兩步法(EliVision、EnVision)可避免生物素干擾。

　　7、細(xì)胞核著色

　　不適當(dāng)?shù)慕M織處理可以出現(xiàn)細(xì)胞核著色，如組織在二甲苯里浸泡時(shí)間太長(zhǎng)(如從星期五浸泡到下星期一)、緩沖液中浸泡時(shí)間太長(zhǎng)、組織變干、微波修復(fù)液的PH值和修復(fù)時(shí)間不當(dāng)或修復(fù)過程中修復(fù)液留下得太少，未沒過組織等。解決辦法是嚴(yán)格按照操作常規(guī)進(jìn)行工作。

　　6、間質(zhì)著色

　　著色部位主要在間質(zhì)，間質(zhì)著色的原因很多，如抗體與組織中的蛋白質(zhì)因蛋白疏水基團(tuán)相互作用形成非特異性的連接而著色，加一抗前的血清封閉這一步就是為了避免非特異型的結(jié)合。又如血清中的免疫球蛋白常常滲出到組織間質(zhì)，很容易與抗體結(jié)合，造成間質(zhì)著色，特別是lambda和kappa染色時(shí)。當(dāng)甲狀腺膠質(zhì)外溢到組織間質(zhì)時(shí)，做甲狀腺球蛋白染色也會(huì)出現(xiàn)間質(zhì)著色？贵w不純或抗體被污染也可出現(xiàn)間質(zhì)著色，我們?cè)龅紺D20抗體不純，除了染上B細(xì)胞外還染上了間質(zhì)。