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酶標(biāo)儀的使用方法及注意事項(xiàng)

[2017/6/13]

酶標(biāo)儀即酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的專用儀器又稱微孔板檢測(cè)器。可簡(jiǎn)單地分為半自動(dòng)和全自動(dòng)2大類，但其工作原理基本上都是一致的，其核心都是一個(gè)比色計(jì),即用比色法來(lái)進(jìn)行分析。盡管酶標(biāo)儀的發(fā)展極為快速，種類繁多，功能也不斷加強(qiáng)，但其最根本的功用是不變的，即比色測(cè)定。


酶標(biāo)儀的使用方法

一、測(cè)定波長(zhǎng)

目前國(guó)內(nèi)常見的ELISA試劑盒所使用的標(biāo)記用酶均為辣根過(guò)氧化物酶(HRP)，底物通常為四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和鄰苯二胺(OPD)，其在過(guò)氧化氫溶液的存在下，經(jīng)HRP作用，分別氧化為2,2,-二氨基偶氮苯(DAB)和聯(lián)苯醌。當(dāng)pH值為5.0左右時(shí)，DAB在450nm波長(zhǎng)處有最大吸收，當(dāng)pH值降為L(zhǎng)0時(shí)，最大吸收波長(zhǎng)移至492nm,同時(shí)摩爾消光系數(shù)變大，顯色加深，因而常用強(qiáng)酸如硫酸或鹽酸終止反應(yīng)。TMB的氧化產(chǎn)物聯(lián)苯醌在波長(zhǎng)450nm處有最大消光系數(shù)，如果HRP量少，H:O:和TMB過(guò)量時(shí)，則形成藍(lán)色的陽(yáng)離子根。降低pH,即可使藍(lán)色的陽(yáng)離子根轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色的聯(lián)苯醌，使用硫酸作為終止劑可使產(chǎn)物穩(wěn)定90min。因此，450nm和492nm兩個(gè)波長(zhǎng)是目前ELISA測(cè)定最常用的。
　　
酶標(biāo)儀有單波長(zhǎng)和雙波長(zhǎng)檢測(cè)功能有時(shí)使用者不知在什么情況下使用單或雙波長(zhǎng)檢測(cè)。所謂的“單波長(zhǎng)”就是使用一種對(duì)顯色具最大吸收的波長(zhǎng)即450nm或492nm進(jìn)行比色測(cè)定；而“雙波長(zhǎng)”則除了用對(duì)顯色具最大吸收的波長(zhǎng)即450nm或492nm進(jìn)行比色測(cè)定外，同時(shí)用對(duì)特異顯色不敏感的波長(zhǎng)如630nm進(jìn)行測(cè)定，酶標(biāo)儀最后打印出來(lái)的吸光度則為二者之差。630nm波長(zhǎng)下得到的吸光度是非特異的，來(lái)自于板子上諸如指紋、灰塵、臟物等所致的吸收。因此，在ELISA比色測(cè)定中，最好使用雙波長(zhǎng)，且不必設(shè)空白孔。

二、測(cè)定的吸光度范圍
　　通常，酶標(biāo)儀的吸光度測(cè)定范圍在。0-2.5之間即可以滿足ELISA的測(cè)定要求。早期的酶標(biāo)儀可測(cè)定的吸光度一般在0-2.5之間，但現(xiàn)在基本上都做了拓寬，可達(dá)到3.5以上，并且能保持很好的精密度與線性。

三、光學(xué)系統(tǒng)
　　酶標(biāo)儀的光學(xué)系統(tǒng)采用的是垂直光路多通道(通常為8或12通道，亦有單通道)檢測(cè)，一般為硅光管或光導(dǎo)纖維，除測(cè)定通道外，有的酶標(biāo)儀還有一個(gè)參比通道，每次測(cè)定可進(jìn)行自我校準(zhǔn)。酶標(biāo)儀的光學(xué)系統(tǒng)功能如何，均可通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定的吸光度范圍、線性度、精密度和準(zhǔn)確度等體現(xiàn)出來(lái)。光學(xué)系統(tǒng)好的話，則上述指標(biāo)也應(yīng)較佳。測(cè)定的精密度與測(cè)定通道之間的均一性有直接關(guān)系。單通道可避免因通道不同所致的差異。

四、檢測(cè)速度
　　酶標(biāo)儀的檢測(cè)速度是指其完成比色測(cè)定所需要的時(shí)間。檢測(cè)速度快，有利于提高檢測(cè)的精密度，即避免由于測(cè)定過(guò)程中，因測(cè)定時(shí)間不同所致的各微孔間吸光度間的差異。

五、震板功能
　　酶標(biāo)儀的震板功能是指酶標(biāo)儀在對(duì)ELISA板孔進(jìn)行比色測(cè)定前對(duì)其進(jìn)行振蕩混勻，使板孔內(nèi)顏色均一。目前市場(chǎng)上常見的酶標(biāo)儀均有震板功能，所不同的是震板方式，有的可按上下、左右或旋轉(zhuǎn)等方式及振蕩幅度等任意調(diào)節(jié)。使用有震板功能的酶標(biāo)儀，在進(jìn)行ELISA測(cè)定顯色反應(yīng)完成加入終止劑后，可不必振蕩混勻，直接放人酶標(biāo)儀上測(cè)定即可。

六、溫育功能
　　溫育功能是指酶標(biāo)儀本身能按要求自動(dòng)精確地控制儀器內(nèi)部的溫度，使得ELISA測(cè)定中微孔板條的溫育過(guò)程可在儀器內(nèi)部完成，而無(wú)需再外配溫箱。目前，只有少部分酶標(biāo)儀具有此種功能。

七、軟件功能
　　軟件功能是指酶標(biāo)儀所具有的對(duì)ELISA定性和定量測(cè)定及其他測(cè)定方式如酶標(biāo)動(dòng)力學(xué)、紫外和凝集等數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析并報(bào)告結(jié)果的功能。軟件功能是中高檔酶標(biāo)儀的一個(gè)非常重要的功能。如果硬件方面區(qū)別不大，則軟件就成為判定酶標(biāo)儀優(yōu)劣的惟一指標(biāo)。對(duì)于用戶來(lái)說(shuō)，好的軟件功能，對(duì)實(shí)際工作會(huì)有較大的幫助。ELISA定性測(cè)定，酶標(biāo)儀如具有陽(yáng)性判斷值(cut-off)及其測(cè)定“灰區(qū)”(即指測(cè)定吸光度處于cut-off周圍的一定區(qū)域，此區(qū)域內(nèi)結(jié)果應(yīng)為“可疑”)的統(tǒng)計(jì)計(jì)算功能，不但方便了實(shí)驗(yàn)室工作人員，而且在某些特定的情況下，有很高的實(shí)用價(jià)值。有研究表明，四參數(shù)方程能較好地反映免疫測(cè)定的劑量反應(yīng)曲線，最為適合于定量酶免疫測(cè)定的曲線擬合。因此，如目的是定量測(cè)定，則在酶標(biāo)儀的軟件功能中，最好要有這種曲線回歸方程計(jì)算分析功能。其他諸如連點(diǎn)、直線等回歸計(jì)算，則可根據(jù)酶標(biāo)儀的應(yīng)用目的而定，如兼用于微量生化測(cè)定，則此類回歸計(jì)算就很有必要。

八、語(yǔ)言界面
　　通常進(jìn)口的中高檔酶標(biāo)儀人機(jī)對(duì)話多采用英文。這對(duì)于某些基層實(shí)驗(yàn)室可能會(huì)存在語(yǔ)言方面的困難，從而難以最大限度地發(fā)揮酶標(biāo)儀的作用。為解決這方面的問(wèn)題，已有一些酶標(biāo)儀采用了中文界面。這樣就大大方便了廣大基層實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員的使用。

酶標(biāo)儀的使用注意事項(xiàng)
　　
　　1、工作環(huán)境
　　
　　酶標(biāo)儀是一種精密的光學(xué)儀器，因此良好的工作環(huán)境不僅能確保其準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，還能夠延長(zhǎng)其使用壽命。根據(jù)DINVDE0871條例，儀器應(yīng)放置在無(wú)磁場(chǎng)和干擾電壓的位置。依據(jù)DIN45635-19條例：
　　
　　儀器應(yīng)放置在低于40分貝的環(huán)境下。
　　
　　為延緩光學(xué)部件的老化，應(yīng)避免陽(yáng)光直射。
　　
　　操作時(shí)環(huán)境溫度應(yīng)在15℃-40℃之間，環(huán)境濕度在15%-85%之間。
　　
　　操作電壓應(yīng)保持穩(wěn)定。
　　
　　操作環(huán)境空氣清潔，避免水汽，煙塵。
　　
　　保持干燥、干凈、水平的工作臺(tái)面，以及足夠的操作空間。
　　
　　2、操作注意事項(xiàng)
　　
　　酶標(biāo)儀的功能是用來(lái)讀取酶聯(lián)免疫試劑盒的反應(yīng)結(jié)果，因此要得到準(zhǔn)確結(jié)果，試劑盒的使用必須規(guī)范。許多醫(yī)院在使用酶標(biāo)儀之前是通過(guò)目測(cè)判斷結(jié)果，操作過(guò)程隨意性較大，在使用酶標(biāo)儀后如果不能及時(shí)糾正操作習(xí)慣，會(huì)造成較大誤差。在酶標(biāo)儀的操作中應(yīng)注意以下事項(xiàng)：
　　
　　使用加液器加液，加液頭不能混用。
　　
　　洗板要洗干凈。如果條件允許，使用洗板機(jī)洗板，避免交叉污染。
　　
　　嚴(yán)格按照試劑盒的說(shuō)明書操作，反應(yīng)時(shí)間準(zhǔn)確。
　　
　　在測(cè)量過(guò)程中，請(qǐng)勿碰酶標(biāo)板，以防酶標(biāo)板傳送時(shí)擠傷操作人員的手。
　　
　　請(qǐng)勿將樣品或試劑灑到儀器表面或內(nèi)部，操作完成后請(qǐng)洗手。
　　
　　如果使用的樣品或試劑具有污染性、毒性和生物學(xué)危害，請(qǐng)嚴(yán)格按照試
　　
　　劑盒的操作說(shuō)明，以防對(duì)操作人員造成損害。
　　
　　如果儀器接觸過(guò)污染性或傳染性物品，請(qǐng)進(jìn)行清洗和消毒。
　　
　　不要在測(cè)量過(guò)程中關(guān)閉電源。
　　
　　對(duì)于因試劑盒問(wèn)題造成的測(cè)量結(jié)果的偏差，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況及時(shí)修改參數(shù)，以達(dá)到最佳效果。
　　
　　使用后蓋好防塵罩。
　　
　　出現(xiàn)技術(shù)故障時(shí)應(yīng)及時(shí)與廠家聯(lián)系，切勿擅自拆卸酶標(biāo)儀。