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流式細(xì)胞儀操作規(guī)程

[2011/3/9]

　　關(guān)鍵詞：流式細(xì)胞儀

　　目的：流式細(xì)胞儀開機(jī)程序、預(yù)設(shè)獲取模式文件、設(shè)定和調(diào)整、樣品分析、關(guān)機(jī)程序

　　一.開機(jī)程序

　　1.檢查穩(wěn)壓器電源，打開電源，穩(wěn)定5分鐘。

　　2.打開儲(chǔ)液箱，倒掉廢液, 并在廢液桶中加入400ml漂白水原液。打開壓力閥，取出鞘液桶，將鞘液桶加至4/5滿(一般可用三蒸水，做分選必須用PBS或FACSFlow)，合上壓力閥。確實(shí)蓋緊桶蓋，檢查所有管路是否妥善安置。

　　3.將FACSCalibur開關(guān)打開，此時(shí)儀器功能控制鈕的顯示應(yīng)是STANDBY，預(yù)熱5-10分鐘。排出過(guò)濾器內(nèi)的氣泡。

　　4.如果需要打印，打開打印機(jī)電源。

　　5.打開電腦,等待屏幕顯示出標(biāo)準(zhǔn)的蘋果標(biāo)志。

　　6.執(zhí)行儀器PRIME功能一次，以排除Flow cell中的氣泡。

　　7.分析樣品時(shí)，先用FACAFlow 或PBS進(jìn)行HIGH RUN約2分鐘。

　　做過(guò)分選后，每次開機(jī)后需沖洗管道：向分選裝置上裝上兩個(gè)50ml離心管，不接通濃縮系統(tǒng)，摁下右下角白色按鈕開始沖洗。待自動(dòng)停止后接通濃縮裝置，同上法沖洗一次。

　　二.預(yù)設(shè)獲取模式文件(Acquisition Template Files)

　　1.從蘋果標(biāo)志中選擇CELLQuest見一個(gè)新視窗，可利用此視窗編輯一個(gè)獲取模式文件。

　　2.選取屏幕左列繪圖工具中的Dot plot，繪出一個(gè)或多個(gè)Dot Plots(點(diǎn)圖)。從Dot Plot對(duì)話框中選取Acquisition作為圖形資料來(lái)源，并確定適當(dāng)?shù)膞軸和y軸參數(shù)。

　　3.選取屏幕左列繪圖工具中的Histogram，同上法可繪出Histogram(直方圖)。

　　4.將此視窗命名后儲(chǔ)存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest Folder \EXP文件夾中，下次進(jìn)行相同實(shí)驗(yàn)時(shí)可直接調(diào)用。

　　本計(jì)算機(jī)中已設(shè)定兩個(gè)模式文件：ACQ和EXP，儲(chǔ)存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest \EXP文件夾中，ACQ用于細(xì)胞DNA檢測(cè)，EXP用于細(xì)胞表面標(biāo)志分析。

　　三.用CELLQuest進(jìn)行儀器的設(shè)定和調(diào)整

　　1.從蘋果畫面中選取CELLQuest，進(jìn)入CELLQuest后在File指令欄中打開合適的獲取模式文件。

　　2.從屏幕上方Acquire指令欄中，選取Connect to Cytometer(快捷鍵： +B)進(jìn)行電腦和儀器的連機(jī)。將出現(xiàn)的Acquisiton Control對(duì)話框移至合適位置。

　　3.從Cytometer指令欄中，開啟Detectors/Amps、Threshold、Compensation、Status等四個(gè)對(duì)話框，并將它們移至屏幕右方，以便獲取數(shù)據(jù)時(shí)隨時(shí)調(diào)整獲取條件。也可以用 +1，2，3，4獲得此四個(gè)對(duì)話框。

　　4.在Detectors/Amps對(duì)話框中，先為每個(gè)參數(shù)選擇適當(dāng)?shù)谋对瞿Ｊ?amplifier mode)：線性模式Lin或?qū)?shù)模式Log。一般進(jìn)行細(xì)胞表面抗原分析如分析外周血的淋巴細(xì)胞亞群時(shí)，F(xiàn)SC和SSC多以線性模式Lin測(cè)量，且DDM Param選擇FL2，而FL1, FL2與FL3則以對(duì)數(shù)模式Log測(cè)量;分析細(xì)胞DNA含量時(shí)，F(xiàn)SC，SSC，F(xiàn)L1，F(xiàn)L2，F(xiàn)L3皆以Lin進(jìn)行測(cè)量，且DDM Param選擇FL2;分析血小板表型時(shí)，F(xiàn)SC，SSC，F(xiàn)L1，F(xiàn)L2，F(xiàn)L3等均以Log進(jìn)行測(cè)量。

　　5.放上待檢測(cè)的樣品，將流式細(xì)胞儀設(shè)定于RUN，流速可在HIGH 或LOW上。

　　6.在Acquisiton Control對(duì)話框中，選取Acquire，開始獲取細(xì)胞。在以下的儀器調(diào)整過(guò)程中隨時(shí)選取Pause，Restart以觀察調(diào)整效果。未完全調(diào)整好之前不要去掉SETUP前的“”。

　　7.在Detectors/Amps對(duì)話框中，調(diào)整FSC和SSC探測(cè)器中的信號(hào)倍增度：PMT voltages(粗調(diào))與Amp Gains(細(xì)調(diào))，使樣品信號(hào)出現(xiàn)在FSC-SSC點(diǎn)圖內(nèi),且三群細(xì)胞合理分布。

　　8.在Threshold 對(duì)話框中選擇適當(dāng)?shù)膮?shù)設(shè)定Threshold，并調(diào)整Threshold的高低，以減少噪音信號(hào)(細(xì)胞碎片)。一般做細(xì)胞表型時(shí)用FSC-H而做DNA時(shí)用FL2-H。Threshold并不影響檢測(cè)器對(duì)信號(hào)的獲取，但可改善畫面質(zhì)量。

　　9.從屏幕左列繪圖工具中選取Region(區(qū)域)，并在靶細(xì)胞周圍設(shè)定區(qū)域線，即通常所說(shuō)的門。圈定合適的細(xì)胞群可使儀器調(diào)整更為容易。

　　10.Detectors/Amps對(duì)話框中，調(diào)整熒光檢測(cè)器(FL1, FL2, FL3, FL4等)的倍增程度。根據(jù)所用的熒光陰性對(duì)照樣品調(diào)整細(xì)胞群，使之分布在正確的區(qū)域內(nèi)。

　　11.在Compensation對(duì)話框中，根據(jù)所用的調(diào)補(bǔ)償用標(biāo)準(zhǔn)熒光樣品調(diào)整雙色(或多色)熒光染色所需的熒光補(bǔ)償。比如應(yīng)該為FL1+ FL2- 的細(xì)胞群卻分布在FL1+ FL2+區(qū)域內(nèi)，則需調(diào)大FL2-?%FL1中的“?”，并從FL1-FL2點(diǎn)圖中觀察新的調(diào)整是否恰當(dāng)

　　12.在Status對(duì)話框中可見：Laser Power:正常值—Run/Ready為14.7mW，Standby為5mW;Laser current:正常值為6Amps左右。

　　13.調(diào)整好的儀器設(shè)定可在Instrument Settings對(duì)話框中儲(chǔ)存，下次進(jìn)行相同實(shí)驗(yàn)時(shí)可調(diào)出使用，屆時(shí)只需微調(diào)即可。

　　本計(jì)算機(jī)中已有三個(gè)名叫儲(chǔ)存于FACStation G3 \BD Applications \CELLQuest Folder \IMM-InstrSettings及FACStation G3 \BD Files \Instrument Settings Files \CalibFile和Mast-Cell-Set的參數(shù)文件，前二者可用于分析人白細(xì)胞，后者用于分析小鼠肥大細(xì)胞。

　　四.通過(guò)預(yù)設(shè)的獲取模式文件進(jìn)行樣品分析

　　1.從蘋果標(biāo)志中選擇CELLQUEST，新視窗出現(xiàn)后從File指令欄中選擇Open，打開預(yù)設(shè)的獲取模式文件。

　　2.從屏幕上方Acquire指令欄中，選取Connect to Cytometer進(jìn)行電腦和儀器的連機(jī)。將出現(xiàn)的Acquisiton Control對(duì)話框移至合適位置。

　　3.從Cytometer指令欄中選取Instrument Settings，在其對(duì)話框中選擇Open以調(diào)出以前存儲(chǔ)的相同實(shí)驗(yàn)的儀器設(shè)定，按Set 確定。

　　4.在Acquire指令欄中，選擇Acquisition&Storage決定儲(chǔ)存的細(xì)胞數(shù)，參數(shù)，信號(hào)道數(shù)。其中Resolution在做細(xì)胞表面標(biāo)志時(shí)選擇256，做DNA時(shí)選擇1024。Parameter Saved…則根據(jù)不同的檢測(cè)對(duì)象選擇不同的參數(shù)。

　　5.在Acquire指令欄中，選擇Parameter Description，以決定文件存儲(chǔ)位置(folder)，文件名稱(file)，樣品代號(hào)以及各種參數(shù)的標(biāo)記(panel)，即安排tube1，2，3…的檢測(cè)參數(shù)。一般本儀器獲取的數(shù)據(jù)按照檢測(cè)對(duì)象的不同分別儲(chǔ)存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest \IMM 和DNA 文件夾中。文件根據(jù)日期命名。

　　6.在Cytometer指令欄中，選擇Counters，將此對(duì)話框移至合適位置，以便于隨時(shí)觀察events計(jì)數(shù)。

　　7.將樣品試管放至檢測(cè)區(qū)，在Acquire Control對(duì)話框中選取Acquire以啟動(dòng)樣品分析測(cè)定。

　　8.微調(diào)儀器設(shè)定，待細(xì)胞群分布合適后選擇Acquire Control對(duì)話框中Pause, Abort, 去除Setup前的“”，開始正式獲取信號(hào)，存儲(chǔ)數(shù)據(jù)。

　　9.當(dāng)一定數(shù)目的細(xì)胞被測(cè)定后，獲取會(huì)自動(dòng)停止，并會(huì)自動(dòng)存儲(chǔ)數(shù)據(jù)。重復(fù)步驟7，繼續(xù)分析下一個(gè)樣品，直到所有的樣品數(shù)據(jù)分析完畢。

　　當(dāng)所有樣品分析分析完畢，即換上三蒸水，并將流式細(xì)胞儀置于“STANDBY”狀態(tài)，以保護(hù)激光管。

　　五.關(guān)機(jī)程序：

　　1.從File中選擇Quit, 退出軟件，選擇Don’t Save至蘋果屏幕。

　　2.用4ml 1：10稀釋的漂白水作樣品，將樣品置于旁位(vacuum is on)，以外管吸去約2ml，在將樣品架置于中位(vacuum is off)，再HIGH RUN 5分鐘(內(nèi)管吸去2ml)。

　　3.改用三蒸水4ml作樣品,同上處理。

　　4.按Prime三次。

　　5.此時(shí)儀器自動(dòng)轉(zhuǎn)為STANDBY狀態(tài)，換2ml三蒸水。必須在儀器處于“STANDBY”狀態(tài) 10分鐘后再依次關(guān)掉計(jì)算機(jī)、打印機(jī)、主機(jī)、穩(wěn)壓電源，以延長(zhǎng)激光管壽命，并確保應(yīng)用軟件的正常運(yùn)行。

　　6.填寫使用登記表。