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凝膠過(guò)濾膜的新用途-賽多利斯實(shí)驗(yàn)室

[2019/3/26]

通過(guò)使用水溶性12602 Sartorius Stedim Biotech凝膠過(guò)濾膜采集病毒，在德國(guó)格賴(lài)夫斯瓦爾德的一家兒童綜合診所檢測(cè)經(jīng)空氣傳播的甲型（H3N2）流感病毒。

引言

雖然基于撞擊原理撞擊采集器早就證明了其采集微生物氣溶膠的可靠性，但是隨著水溶性凝膠過(guò)濾技術(shù)的發(fā)展以及這種過(guò)濾膜僅在采集細(xì)菌氣溶膠方面廣泛的應(yīng)用，直到總部位于哥廷根的賽多利斯斯泰帝生物技術(shù)有限公司開(kāi)始商業(yè)化生產(chǎn)這種凝膠過(guò)濾膜之后，才使得過(guò)濾法在最近獲得越來(lái)越多的關(guān)注。

 

迄今為止，凝膠膜用于檢測(cè)和采集病毒氣溶膠的價(jià)值被認(rèn)為是有限的，且凝膠膜還可以用于采集穩(wěn)定的抗性病毒（如果有用的話(huà)）。截止到目前，這方面的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)都非常少。

 

Jaschhof團(tuán)隊(duì)使用Sartorius Stedim Biotech凝膠過(guò)濾膜（12602）對(duì)通過(guò)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的T1和T3大腸桿菌噬菌體和A|PR|8|34（H1N1）流感病毒的靜止氣溶膠進(jìn)行采集，對(duì)這些病毒的采集實(shí)現(xiàn)了恒定的采集效率，即使在高入口速度（最高達(dá)1.6m/s）和延長(zhǎng)采集時(shí)間（最長(zhǎng)15分鐘）的條件下也是如此。


凝膠過(guò)濾膜對(duì)機(jī)械應(yīng)力的高耐性和已證實(shí)的流感病毒的穩(wěn)定性是在1990年初（第3-5周）急性呼吸道疾。ˋRD）發(fā)病呈季節(jié)性上升期間測(cè)試該方法在實(shí)踐中有效性的原因。本研究建立在通過(guò)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的病毒和噬菌體氣溶膠的測(cè)試結(jié)果基礎(chǔ)上。

 

在格賴(lài)夫斯瓦爾德兒童綜合診所的候診室內(nèi)抽取空氣樣本3天，然后將水溶性過(guò)濾材料用于病毒培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。平行進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)從候診室中新患有急性呼吸道疾病的兒童抽吸獲得的鼻分泌物中分離的病毒。


材料和方法

研究地點(diǎn)

格賴(lài)夫斯瓦爾德兒童診所的候診室（約120 m³），兩個(gè)小時(shí)內(nèi)最多有在父母陪同下的57名兒童（1990年1月24日）。溫度：25°C，60% 相對(duì)濕度。


實(shí)驗(yàn) | 測(cè)試材料：

新患有急性呼吸道疾病兒童的鼻分泌物。凝膠過(guò)濾膜，12602，過(guò)濾1.8m³的室內(nèi)空氣后。然后將其與5ml等滲緩沖液一起密封在聚乙烯袋中，用于在pH 7.4下用0.5％酵母提取物（Difco）、青霉素G（400μl/ml）和鏈霉素（400μg/ml）進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

所有樣本在4小時(shí)內(nèi)進(jìn)行處理（期間儲(chǔ)存在冷卻室中）。

流感病毒A|PR|8|34（H0N1）的掃描電子顯微照片。

來(lái)自11天齡胚胎雞蛋培養(yǎng)物的病毒，經(jīng)蔗糖密度梯度純化。

顯微照片：Herrmann|Fischer


空氣取樣

通過(guò)Sartorius Stedim Biotech凝膠過(guò)濾膜（12602-050）采集15分鐘，每個(gè)過(guò)濾膜（120 I/min）的樣本經(jīng)3天過(guò)濾1.8m³的空氣獲得。


病毒學(xué)分析

鼻分泌物：加入漢克氏溶液（每個(gè)樣本3ml），將樣本離心30分鐘（3,000rpm），每毫升上清液添加10μl抗生素溶液，在室溫下培育1小時(shí)。用這些標(biāo)本接種10天齡孵育蛋的羊膜，在33℃下孵育3天；準(zhǔn)備3個(gè)無(wú)標(biāo)記次培養(yǎng)；HAT用于檢測(cè)病毒。


空氣樣本：過(guò)濾膜在37℃的水浴中液化5分鐘；將上述抗生素溶液加入到用于接種孵育蛋的溶液中；然后培養(yǎng)FL細(xì)胞和腹水腫瘤細(xì)胞；根據(jù)HAT、CPE和HAdT的常規(guī)技術(shù)檢測(cè)病毒。


通過(guò)在HAHT中采用兔流感病毒免疫血清 A|格賴(lài)夫斯瓦爾德|1|89（H1N1）和A|格賴(lài)夫斯瓦爾德|1|90（H3N2）以及流感病毒A|四川|2|87（H3N2）和流感病毒A|格賴(lài)夫斯瓦爾德|2|88（H3N2）的抗原進(jìn)行交叉滴定，對(duì)從鼻分泌物和空氣樣本中分離出的流感病毒進(jìn)行歸類(lèi)和鑒定。

 

通過(guò)PAGE測(cè)定v-RNA和病毒蛋白質(zhì)圖譜。


結(jié)果與討論

從1990年1月24日采集的實(shí)驗(yàn)材料中，在第三次傳代培養(yǎng)的孵育卵中成功接種從鼻分泌物中分離的三種類(lèi)型的病毒和從空氣樣本中分離的甲型流感病毒（流感病毒A|格賴(lài)夫斯瓦爾德|2|90[H3N2]）。


HAT顯示分離的病毒和變體A|格賴(lài)夫斯瓦爾德|2|88和A|四川|2|87的抗原在很大程度上是相關(guān)的，與使用凝膠膜進(jìn)行空氣取樣時(shí)從候診室內(nèi)的患者身上所取的鼻分泌物標(biāo)本培養(yǎng)的菌株無(wú)任何差異（流感病毒A|格賴(lài)夫斯瓦爾德|1|90[H3N2]）。

 

分離的病毒蛋白（HA、NP、NS和M）及其v-RNA的所有條帶在PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳）后的遷移率高度匹配（圖1）。使用細(xì)胞培養(yǎng)物嘗試從空氣樣本中進(jìn)一步分離病毒未成功。

圖 1：

在聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）時(shí)，從流感病毒A|格賴(lài)夫斯瓦爾德|1|90（H3N2）（從患者標(biāo)本中分離）和流感病毒A|格賴(lài)夫斯瓦爾德|2|90（從空氣中采集和分離）中分離v-RNA。三醋酸EDTA緩沖液中3.5%的聚丙烯酰胺凝膠。

 

空氣樣本在急性呼吸道疾病發(fā)病流行前采集的事實(shí)證明了用于檢測(cè)空氣中流感病毒的過(guò)濾器采集方法的有效性。

 

研究當(dāng)天有75%的兒童（≥8歲）患有呼吸道感染，但最多只有40%的兒童出現(xiàn)急性卡他性癥狀（咳嗽、打噴嚏、流鼻涕）。在該地區(qū)急性呼吸系統(tǒng)疾病季節(jié)性發(fā)病率略有上升期間的兒童診所候診室的空氣中檢測(cè)到甲型流感病毒，顯著證實(shí)了使用實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的大腸桿菌噬菌體和甲型流感病毒靜止氣溶膠得到的結(jié)果。


這樣首次證明了凝膠過(guò)濾器在實(shí)踐中適合從空氣中采集呼吸道病毒。


展望

考慮到簡(jiǎn)單的空氣過(guò)濾方法涉及到的工作較少，這種使用凝膠過(guò)濾膜的原理必將得到越來(lái)越多的認(rèn)可，有助于解答關(guān)于感染性病毒氣溶膠的產(chǎn)生、穩(wěn)定性和擴(kuò)散的眾多問(wèn)題（例如遺傳工程技術(shù)中）。