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病毒采集出新招，圍觀方法秘籍-賽多利斯實驗室

[2019/4/3]

引 言
根據(jù)采集經(jīng)空氣傳播細菌的經(jīng)驗（Petras 1966，1967；Rotter和Koller 1974），測試比較了凝膠過濾器以及撞擊采樣器和標準撞擊器（AGI-30型）對病毒氣溶膠進行采樣的有效性。
這些研究有兩大目標：
制定過濾病毒氣溶膠和處理用于采集病毒氣溶膠的過濾器的標準方法
測試過濾器是否適合大容量采樣
 
材料和方法

研究
采用實驗產(chǎn)生的大腸桿菌噬菌體靜態(tài)氣溶膠（在寬濕度范圍內(nèi)具有高穩(wěn)定性）、T3大腸桿菌噬菌體和A/PR/8/34（H1N1）流感病毒。氣溶膠是在溫度和相對濕度可調(diào)節(jié)的50 m3的實驗室中使用具有導液器（粒徑≤5μm）的噴射霧化器制成的。氣溶膠使用安裝在16711采集器（Collectron，MD8 airscan空氣采樣器之前的型號）架中的12602凝膠過濾膜過濾。在高流量下，該裝置可與兩臺并聯(lián)的真空泵互換使用（目前的Sartorius MD8 airscan空氣采樣器專為高流量設計）。

標準操作程序和采樣體積由應用于撞擊采集器和AGI-30撞擊器的采樣器工作原理確定。

通過瓊脂覆蓋法（噬斑法）對收集的噬菌體顆粒進行定量測定，使用孵育蛋滴定流感病毒（Mayr等人，1974，1977）或通過在腹水腫瘤細胞培養(yǎng)后進行血吸附測試（Adamczyk等人，1975）。

 
結果

一、通過空氣過濾和過濾器處理對病毒氣溶膠進行取樣的標準程序（T1和流感病毒氣溶膠的結果）
過濾器的0.1-0.4 m/s入口速度不影響過濾器在每升空氣中的感染單位（I.U.）產(chǎn)率。因此，當采集穩(wěn)定性未知的病毒時，建議采樣時間為1-2min，入口速度為22.5 l/min或0.3 m/s。在此過程中，不受高達85%的相對濕度影響的過濾器顯示99.9％或更高的高截留率。
 
通過在瓊脂平板上直接培養(yǎng)凝膠過濾器來確定空氣傳播細菌數(shù)量這一常用方法對病毒氣溶膠是不可行。對于病毒氣溶膠，較切實可行的方法是將過濾器溶解于合適的介質(zhì)中，然后使用實驗室振動器將介質(zhì)充分混合以分解任何微生物|病毒聚集。
 
以下程序已證明是有效的。為了溶解過濾器，在200ml寬頸錐形燒瓶中放入20 ml pH值為7.2的m/15磷酸鹽緩沖液和40個直徑為2.5 mm的玻璃珠。將燒瓶置于調(diào)節(jié)至適當速度的實驗室振動器上，在室溫下?lián)u動溶液5分鐘。緩沖溶液的體積可以減少到2.5 ml，以便濃縮感染顆粒。在此過程中，過濾器完全溶解。

二、使用凝膠過濾器、撞擊采集器和撞擊器根據(jù)標準程序比較采樣T1和T3氣溶膠
對于兩種噬菌體氣溶膠，3種采集方法的效率順序為νF>νI-C>νI（圖1），這有利于過濾器。這種差異產(chǎn)生了其有效性的比例。對于T3氣溶膠，νF：νI-C：νI為4.02：3.76：1，其中過濾器和撞擊采集器之間的差異不顯著。對于T1氣溶膠，比例為2.04：1,44：1（50％相對濕度）；各值之間1％的差異具有重要意義。在氣溶膠濃度108-105個噬菌體顆粒/m3空氣的范圍內(nèi)確認了采集效率的順序，這也是使用標準程序的所有3種采集方法對噬菌體氣溶膠的下檢測限。

圖1  AGI-30撞擊器(I)、凝膠過濾器(F)和撞擊采集器(I–C)間對T1和T3氣溶膠采集效率的比較。

三、用凝膠膜過濾器大體積取樣病毒氣溶膠
作為檢測低病毒顆粒（病毒粒子）濃度的先決條件，大體積量取樣在理論上可以通過以下方式實現(xiàn)：
在特定時間內(nèi)增加流量
延長采樣時間

1.延長采樣時間（T1和甲型流感病毒的結果）：
通過過濾器以0.3 m/s的入口速度對空氣采樣15分鐘（相當于337.5升采樣空氣），不會導致采集的病毒粒子失活。該試驗的取樣程序通過減少緩沖溶液體積以獲得更高的病毒粒子|噬菌體粒子濃度，證明了較低的檢測限可以低轉(zhuǎn)換為102 I.U./m3空氣范圍（圖2）這一數(shù)學理論。

圖2  用于產(chǎn)生氣溶膠的每毫升液體中噬菌體顆粒的濃度與使用凝膠過濾器采集產(chǎn)生的每升空氣中l(wèi).U.的數(shù)量之間的關系。在相對濕度為50-55%和20℃下的T1氣溶膠。
A-E表示采集條件：
A      標準程序（參見一般信息）
B      取樣時間：  5 min，  溶液體積：20   ml
C      取樣時間：15 min，  溶液體積：20   ml
D      取樣時間：  5 min，  溶液體積：  5   ml
E      取樣時間： 15 min， 溶液體積：  5   ml  

2.以更高的流速對病毒氣溶膠采樣：
以更高的入口速度（高達1.8 m/s，相當于135 l/min）和極端環(huán)境條件（最高30°C，相對濕度為90%）在凝膠過濾器上進行的機械應力測試幫助我們在采樣期間在這些更惡劣的條件下測試病毒氣溶膠的穩(wěn)定性。
 
令人驚訝的是，入口速度能夠增加至1.6 m/s，而不會對過濾器的效率產(chǎn)生顯著影響。對于T1氣溶膠，與用作參考量的標準AGI-30撞擊器相比，過濾器的產(chǎn)率為140%（圖3）。在入口速度為1.8 m/s時，產(chǎn)率下降至撞擊器的107%。
 
通過計算氣流的雷諾數(shù)，可以根據(jù)由空氣湍流引起的采樣過程產(chǎn)生的物流干擾追蹤產(chǎn)率下降的原因。即使在15分鐘的采樣時間內(nèi)，T1大腸桿菌噬菌體和甲型流感病毒（圖4）都顯示出較高的穩(wěn)定性。


圖3  在20℃和相對濕度為55%的情況下對T1氣溶膠取樣后的凝膠過濾器的產(chǎn)率作為過濾器入口速度的函數(shù)。


圖4  凝膠過濾器采集流感病毒氣溶膠的效率作為過濾器入口速度和采樣時間的函數(shù)（6次試驗）。

此外，對于T1大腸桿菌噬菌體，已經(jīng)證實，即使在相對濕度為90％的情況下，過濾器的采集效率在惡劣的空氣取樣條件下依然保持恒定。值得注意的是，即使在極端應力下，過濾器對T1氣溶膠的截留能力仍保持在99.82％的平均水平。在30℃和80-85％相對濕度下，在15分鐘的采樣時間內(nèi)，經(jīng)過測試的過濾器最大應力達到1.6 m/s的入口速度。對于T1氣溶膠，過濾器的平均截留率為99.76%。
 
在這些條件下，過濾器的一致性、穩(wěn)定性和處理性能發(fā)生明顯改變。
 
過濾器的周邊被濃縮水分的液滴濕潤。雖然過濾器未粘附到過濾器支架底部且很容易除去，但出現(xiàn)了像橡膠一樣的濃度變化。
 
掃描電子顯微照片顯示，在這些極端條件下，膜的網(wǎng)狀壁結構膨脹到其正常直徑的兩倍或三倍。但是，過濾器的基本結構保持穩(wěn)定。

 
評估總結

在成功使用凝膠過濾器采集經(jīng)空氣傳播的細菌之后，現(xiàn)在也已證明凝膠過濾器適用于采集病毒氣溶膠。
 
凝膠過濾器可為整個生物氣溶膠（細菌、霉菌和病毒）系列提供可靠的采集方法。
 
使用過濾器進行采集的優(yōu)點對病毒檢測尤為重要，這些優(yōu)點包括：
在寬流量/分鐘范圍內(nèi)具有恒定的采集效率。
即使在溫度和相對濕度的極端環(huán)境條件下，也能保持過濾器的高截留能力。
過濾器中的凝膠能起到像保護性病毒蛋白質(zhì)衣殼一樣的作用，保護病毒免受表面滅活影響。
使用凝膠過濾法不受病毒濃度影響。
該方法在采樣之前的準備過程中以及之后的處理和評估期間需要的工作和材料都較少。
采集的病毒粒子可以在不同的細胞系上平行培養(yǎng)。

 
使用凝膠膜過濾法采集
病毒和噬菌體的一般信息

程序步驟
一、采集病毒和噬菌體：

帶有凝膠過濾器的MD8 airscan空氣采樣器，一次性80 mmφ過濾器
* 此處給出的應用數(shù)據(jù)是使用具有50 mm凝膠過濾器的之前型號16711確定的
二、處理凝膠膜過濾器，將其溶解并在溶液中振動：

三、檢測病毒和噬菌體：
四、通過儲存使用過濾器來穩(wěn)定截留的病毒氣溶膠，一直儲存至處理前：